《DNA提取和pcr扩增》PPT课件.ppt
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1、实验三:DNA提取及PCR反应蒋建伟第一部分:第一部分:DNA提取提取一、一、DNA提取的基本步骤提取的基本步骤三、三、DNA提取常见问题与对策提取常见问题与对策二、二、DNA提取注意事项提取注意事项一、DNA提取的基本步骤 I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放 III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸,并去除杂质沉淀或吸附核酸,并去除杂质 V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中DNA提取(一)样品准备:(一)样品准备:1 1、组织:、组织:3g组组织织,用用8层层纱纱布布包包好好,再再包包多多
2、层层牛牛皮皮纸纸,浸浸入入液液氮氮,取取出出,用用木木锤敲碎。锤敲碎。碎组织放入搪瓷钵中,加少量液氮,碾磨至粉末状。碎组织放入搪瓷钵中,加少量液氮,碾磨至粉末状。在在50ml离离心心管管中中,加加10mlDNA提提取取液液,用用玻玻棒棒边边搅搅动动液液体体,边边加加入入组织粉末,组织粉末,37混匀。混匀。2、组组织织,3g,-70保保存存,临临用用时时用用玻玻璃璃匀匀浆浆器器,用用DNA提提取取液液 将将组组织织磨成匀浆。磨成匀浆。注:DNA提取液提取液 见见 p-8 或或 p-11,下同。下同。(一)样品准备(一)样品准备3、培养细胞、培养细胞消化收集细胞,消化收集细胞,PBS洗洗3次,加次
3、,加10mlDNA提取液提取液,混匀。,混匀。4、血液、血液取血液离心,取淡黄色白细胞层,加取血液离心,取淡黄色白细胞层,加NS,离心。,离心。或者加或者加2O,离心,收集白细胞。,离心,收集白细胞。加加10mlDNA提取液提取液,37mix。(一)样品准备(一)样品准备(二)提(二)提DNA酚抽提法:酚抽提法:加加RNase,371h,加蛋白酶加蛋白酶K,50,3h;或或3712h,不时不时mix加等体积酚,充分加等体积酚,充分mix,9000rpm,3min,小心吸取上层粘稠水相。,小心吸取上层粘稠水相。加等体积酚,充分加等体积酚,充分mix,9000rpm,3min,小心吸取上层粘稠水相
4、。,小心吸取上层粘稠水相。氯氯仿仿-异异戊戊醇醇(24:1)抽抽提提1次次。9000rpm,3min,小小心心吸吸取取上上层层粘粘稠稠水相。水相。移到移到50ml烧杯中,加烧杯中,加倍体积冷无水乙醇,用玻棒钩出倍体积冷无水乙醇,用玻棒钩出DNA。TE溶解。溶解。2 2、异丙醇沉淀法:、异丙醇沉淀法:原理:原理:用用2倍倍体体积积异异丙丙醇醇沉沉淀淀DNA溶溶液液,DNA沉沉淀淀是是丝丝状状,而而RNA溶溶于于异异丙丙醇醇中中,可可除去除去RNA。细胞,细胞,PBS洗洗2次。次。3mlTEN重悬,加重悬,加DNA提取液提取液,蛋白酶,蛋白酶K,5014h加等体积饱和酚,混匀,加等体积饱和酚,混匀
5、,9000rpm3min,小心吸取上层粘稠水相。,小心吸取上层粘稠水相。氯仿氯仿-异戊醇异戊醇(24:1)抽提抽提1次,次,9000rpm3min,小心吸取上层粘稠水相。,小心吸取上层粘稠水相。加加2倍体积的异丙醇,用玻棒钩出倍体积的异丙醇,用玻棒钩出DNA。TE溶解。溶解。(二)提(二)提DNAq SDS法法-提取提取DNASDS是是一一种种阴阴离离子子去去垢垢剂剂,在在高高温温(5565)条条件件下下能能裂裂解解细细胞胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;提提高高盐盐(KAc或或NH4Ac)浓浓度度并并降降低低温温度度(冰冰浴浴),使使蛋蛋白白质质及及
6、多多糖糖杂质沉淀,离心后除去沉淀;杂质沉淀,离心后除去沉淀;上上清清液液中中的的DNA用用酚酚/氯氯仿仿抽抽提提,反反复复抽抽提提后后用用乙乙醇醇沉沉淀淀水水相相中中的的DNA。组份组份Tris-HCl(pH8.0)EDTA(pH 8.0)NaCl SDS终浓度终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法法DNA提取缓冲液提取缓冲液小小 结结q SDSSDS法流程图法流程图 (以动物组织为例)(以动物组织为例)动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组DNASDS法qCTAB法法CT
7、AB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基十六烷基三甲基溴化铵溴化铵),),是一种阳离子去污剂,可是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。物。该复合物在高盐溶液中(该复合物在高盐溶液中()是可溶的,可通过有机溶剂抽提是可溶的,可通过有机溶剂抽提,去除,去除蛋白、多糖、酚类等杂质,加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。蛋白、多糖、酚类等杂质,加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注:注:CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热,
8、且离心时温度不要低于植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15。举举 例例qCTAB提取缓冲液提取缓冲液 的经典配方的经典配方 组份组份 Tris-HCl (pH8.0)EDTA(pH8.0)NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%(V/V)使用前加)使用前加入入Tris-HCl()提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子,抑制离子,抑制DNase活性;活性;NaCl 提供一个高盐环境,使提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;充分溶解,存在于液
9、相中;CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA CTAB法qCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方 组份组份 Tris-HCl(pH8.0)EDTA(pH8.0)NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%(V/V)使用前加入使用前加入vPVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶聚乙烯吡咯烷酮)是酚
10、的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。和多糖结合,有效去除多糖。基因组DNA CTAB法qCTAB法流程图:法流程图:植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液二、二、DNA提取注意事项提取注意事项1.材料准备最好使用新鲜材料,最好使用新鲜材料,低温保存的样品材料不要反复低温保存的样品材料不要反复冻融冻融提取血液基因组提取血液基因组DNA时,要选择有核细胞(白细胞)
11、时,要选择有核细胞(白细胞)组培细胞培养时间不能过长,否则会造成组培细胞培养时间不能过长,否则会造成DNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较少,提取前先富集含量较少,提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取注意事项注意事项2.细胞裂解适量。过多会影响裂解,导致适量。过多会影响裂解,导致DNA量少,纯度低量少,纯度低针对不同材料,选择适当的针对不同材料,选择适当的裂解预处理裂解预处理 方式:方式:植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠
12、高温温浴时,定时轻柔振荡高温温浴时,定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取注意事项注意事项3.核酸分离、纯化:采用有机(酚采用有机(酚/氯仿)抽提时应充分混匀,但动作要轻柔。氯仿)抽提时应充分混匀,但动作要轻柔。离心分离两相时,应保证一定的转速和时间。离心分离两相时,应保证一定的转速和时间。针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相应的去杂质的方针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相应的去杂质的方法。法。基因组基因组DNADNA的提取的提取注意事项注意事项q蛋白质的去除:蛋白质的去除:酚酚/氯仿抽提氯仿抽提使用变性剂变性(使用变性剂变性(SDSSDS、异硫氰酸胍等)异硫氰酸胍等)高盐洗涤
13、高盐洗涤蛋白酶处理蛋白酶处理q多糖的去除:多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/21/2体体积的积的5MNaCl,高盐可溶解多糖。高盐可溶解多糖。用用 多糖水解酶多糖水解酶 将多糖降解。将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的在提取缓冲液中加一定量的氯苯氯苯 (1/2,(1/2,v/vv/v),氯苯,氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖 。用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA:在:在500L DNA500L DNA液中加入液中加入200l 20%PEG200l 20%PEG
14、8000 8000(含含1.2 M NaCl)1.2 M NaCl),冰浴冰浴20min20min。注意事项注意事项q多酚的去除:多酚的去除:在抽提液中加入在抽提液中加入 防止酚类氧化防止酚类氧化 的试剂:的试剂:-巯基乙醇巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如加入易与酚类结合的试剂:如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇),它,它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNADNA的结合的结合q盐离子的去除:盐离子的去除:7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤注意事项注意事项4.核酸沉淀、溶解当沉淀
15、时间有限时,用当沉淀时间有限时,用预冷的预冷的 乙醇或异丙醇沉淀,沉淀会乙醇或异丙醇沉淀,沉淀会更充分。更充分。沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaAc(,3M),),有利于充分沉淀。有利于充分沉淀。沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤,以除去盐离子等。的乙醇洗涤,以除去盐离子等。晾干晾干DNA,让乙醇充分挥发(不要过分干燥)。让乙醇充分挥发(不要过分干燥)。若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。缓冲液溶解。TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子,抑制离子,抑制DNase。pH值为值为,可防止,可防止DNA发生酸解发生酸解。基因组基因组DNADNA的提取的
16、提取注意事项注意事项 三、DNA提取常见问题与对策1.DNA中含有蛋白、中含有蛋白、多糖、多酚类杂质多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前,有在溶解前,有酒精残留,酒精抑酒精残留,酒精抑制后续酶解反应制后续酶解反应3.DNA中残留中残留有金属有金属离子离子1.重新纯化重新纯化DNA,去除蛋去除蛋白、多糖、多酚等杂质白、多糖、多酚等杂质(具体方法见前)(具体方法见前)2.重新沉淀重新沉淀DNA,让酒精让酒精充分挥发充分挥发3.增加增加70乙醇洗涤的次乙醇洗涤的次数(数(2-3次)次)q问题一:问题一:DNA样品不纯,抑制后续酶解和样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应反应。原原因因对对策策DNA提取常见
17、问题与对策1.1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈,烈,DNADNA被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融1.1.尽量取新鲜材料,低温保存材料避尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融。免反复冻融。2.2.液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液。前加入裂解缓冲液。3.3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量丰富的材料的的DNA时,可增加裂解液中时,可增加裂解液中螯合剂螯合剂的含量。的含量。
18、4.4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.5.所有试剂用无菌水配制,耗材经高所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌。温灭菌。6.6.将将DNA分装保存于缓冲液中,避免分装保存于缓冲液中,避免反复冻融。反复冻融。q问题二:问题二:DNA降解降解。对对策策原原因因DNA提取常见问题与对策1.1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失1.1.尽量选用新鲜(幼嫩)的材尽量选用新鲜(幼嫩)的材料。料。2.2.动植物要匀浆研磨充分;动植物要匀浆研磨充分;G G菌、酵母裂解前
19、先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。或机械方式破壁。3.3.高温裂解时,时间适当延长高温裂解时,时间适当延长(对于动物细胞、细菌可增(对于动物细胞、细菌可增加加PK的用量)。的用量)。4.4.低温沉淀,延长沉淀时间。低温沉淀,延长沉淀时间。5.5.加辅助物,促进沉淀。加辅助物,促进沉淀。6.6.洗涤时,最好用枪头将洗涤洗涤时,最好用枪头将洗涤液吸出,勿倾倒。液吸出,勿倾倒。DNA提取常见问题与对策q问题三:问题三:DNADNA提取量少。提取量少。对对策策原原因因 第二节第二节 PCR反应反应 一、一、PCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程 二、PCR标准反应体系:三、三、PC
20、R的反应条件(反应参数)的反应条件(反应参数)四、PCR常见问题与对策 五、PCR衍生技术(略)多聚酶链式反应多聚酶链式反应(PCR:PolymeraseChainReaction)Kary B.MullisKary B.MullisPCR是由美国科学家是由美国科学家Mullis提出的一种提出的一种体外简化条件下模拟体外简化条件下模拟DNA体内复制的体内复制的DNA快速扩增的方法,此技术获得快速扩增的方法,此技术获得1993年诺贝年诺贝尔化学奖。尔化学奖。一、一、PCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程DNA的体外复制包括的体外复制包括3个步骤:个步骤:变性(变性(denaturation)
21、:94 C 95 C 退火(退火(annealing):40 C 70 C 延伸(延伸(extension):72 C 3个步骤作为个步骤作为PCR的一个循环,每当完成一的一个循环,每当完成一个循环,一个分子的模板被复制为二个,个循环,一个分子的模板被复制为二个,产物量以指数形式增长。产物量以指数形式增长。Mullis的的PCR构思构思引物引物引物引物DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定DNADNA片段片段TaqTaq DNADNA聚合酶(聚合酶(thermus aquaticus)thermus aquaticus)酶酶活活性性(%)温度温度温度温度()40 50 60
22、70 80 90 100100 80 60 40 20耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶Saiki(1988)将耐热)将耐热DNA聚合酶引入聚合酶引入PCR,使利用热变性解链,使利用热变性解链DNA模板可行。模板可行。PCR反应循环反应循环7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环变性变性变性变性退火退火退火退火延伸延伸延伸延伸 PCR的指数扩增(的指数扩增(2n)引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 5 5 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火二、PCR标准反应体系:DNA模板模板 引物引物 反应缓冲液反
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