提RNA+逆转录+qRT-PCR步骤模板.doc
《提RNA+逆转录+qRT-PCR步骤模板.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《提RNA+逆转录+qRT-PCR步骤模板.doc(6页珍藏版)》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、|【一、提 RNA】一、实验准备:1、试剂:75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口 EP 管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA 专用)、2、配 75%乙醇(DEPC 水+无水乙醇),放-20冰箱预冷;3、预冷离心机(1.5mL EP 管用的);4、清洁桌面,酒精喷过之后擦干,新手套、两层口罩;二、操作步骤:01、弃上清(不回收,直接倒去);02、1mL/孔 PBS 洗两遍(不回收,直接倒去,随后用 200L 枪吸尽 PBS);03、每孔加 500L Trizol,轻晃,随后室温放置 2min 左右;04、枪头吹打,吸出放入 1.5mL 进口 EP 管;05、加入 100L 氯仿(即 1/5
2、体积的 trizol);06、4离心机,12000g,15min;07、吸 200L(可减少)上清放入新的 1.5mL 进口 EP 管中(注意:只能吸到上清);08、加入等体积异丙醇,充分混匀,常温放置 10-30min(15min);09、4离心机,12000g,10min;10、倒掉液体,加入 1mL 预冷的 75%乙醇剧烈混匀;11、4离心机,7500g,5min;12、倒掉上清,加入 1mL 预冷的 75%乙醇,混匀;13、4离心机,7500g,5min;14、倒掉上清,倒扣在餐巾纸上,5-10min,用针头或者 200 微升枪头去掉管壁上的水珠;15、每管中加入 40L(40-60L
3、)的 DEPC 水,吹打溶解;16、测浓度(先知楼 21 楼测 RNA 浓度,带 DEPC 水、灭菌的 dd 水、10 微升枪和枪头);三、注意事项01、如果当时不测 RNA 浓度,可暂时把 RNA 放在-20冰箱。但长时间(24h)保存,需要放在-80冰箱;02、异丙醇作用是沉淀 RNA,作用比乙醇好;03、04、05、06、07、08、09、|【二、测 RNA 浓度】一、实验准备:01、先知楼 21 楼-2109 教室,一个冰盒+DEPC 水+10 微升枪、灭菌 dd H2O、10L 枪头(RNA 专用)、本子+笔;二、操作步骤:01、登记;02、打开电脑=打开“N”软件=点击“Nucle
4、ic acid”=选择“OK”=选择“RNA”;03、灭菌 dd H2O 清洗 2-3 遍,擦干;04、DEPC 水 校零:即加 DEPC 水一滴,点击“Blank”,擦干;05、测 RNA:加样品一滴,点击“measure”,擦干,随后加下一个样品;06、记录数据,包括 RNA 浓度(0.1。(请注意,这个值跟仪器无关,核酸的吸光度必需大于 0.1,其值才有效和可靠,因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收,其值加 1 号试剂(2L)=加 3 号试剂(0.5L)=加 4 号试剂(0.5L)=加 2 号试剂(0.5L)=加 RNA=离心=上机;02、上机:OPEN=点击“Us
5、er”菜单下的“clx”,点击“Accept”=选择“run”下面的到“exp001 rt”=修改体系“10L”(默认为 25 微升)=点击“Start”,进入界面;03、37.0 15min=85.0 5s=4.0 60min;04、4冰箱保存;三、注意事项01、加液尽量无气泡,枪不要打到底;02、严格冰上操作,防止 RNA 降解;|【qRT-PCR】一、实验准备:01、试剂:Roche 的 SyBr Green(rox)02、1.5mL EP 管、0.2mL EP 管、96 孔板/八连冠;10L、20L、100L、200L、2.5L、1000L 枪;03、冰盒一个、Rox 化冻(避光)、引
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- RNA 逆转录 qRT PCR 步骤 模板
限制150内