原核诱导表达.docx
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1、 原核诱导表达的标准操作程序SOP一目的:使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程,并能实际动手进展原核诱导表达一系列实验。二适用范围:本SOP适用于对新基因克隆的表达,并针对新基因产生的可溶性蛋白。三实验原理: 的乳糖操纵子含Z、Y及A三个构造基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶与乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白CAP结合位点。由P序列、O序列与CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达
2、。在没有乳糖存在时,lac操纵子处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷IPTG是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。四、试剂准备:一实验器材的灭菌:枪头的灭菌:1mL,200L,20L的枪头放入枪头盒,用报纸包住2层,放入高压灭菌锅中灭菌,1
3、21,20min。80烘箱中烘干,常温放置。 螺口管及离心管的灭菌:将螺口管与离心管分别放入铝制饭盒中盖子要拧松,离心管的管盖翻开,放入高压灭菌锅中灭菌,121,20min。80烘箱中烘干,常温放置。50mL离心管的灭菌:将50mL离心管用报纸包住2层,放入高压灭菌锅中灭菌,121,20min。80烘箱中烘干,常温放置。二LB培养基的配制 液体LB培养基1L:蛋白胨 10g 氯化钠 10g 酵母提取物 5g 调PH值到,高压灭菌,4保存。 固体LB培养基1L:蛋白胨 10g 氯化钠 10g 酵母提取物 5g 琼脂粉 15g 高压灭菌,不烫手的情况下参加抗性,抗性:培养基=1:1000氨苄,卡那
4、通常浓度,混匀。马上在无菌操作台中倒平板,并开大风吹干。用封口膜封住,倒置放于4保存。三1M IPTG的配制:经过计算,10g IPTG可以配42ml的1M IPTG。买来的粉末状的IPTG一般全部配成1M IPTG。1、无菌操作台紫外线照射,后通风。2、用少量去离子水将IPTG溶解完全,并定容。3、在无菌操作台中,用2m的滤器将配好的IPTG滤入灭菌后的离心管中,过滤除菌,-20保存。考前须知:在用滤器将IPTG滤入离心管时,先用针头吸IPTG,然后将枪头拔掉,排出气体,滤头参加IPTG液,在使针管与滤器相连,保证整个装置无气体进入。滤的过程中,手不能碰滤头。四3SDS-PAGE loadi
5、ng buffer的配制:3SDS-PAGE loading buffer10ml 1M Tris-Hcl (PH 6.8)SDSBPB(溴酚蓝)30mg甘油丙三醇3ml去离子水1将除BPB以外的药品完全溶解。SDS常温下很难溶解,可以在37水浴溶解。完全溶解后,再参加BPB,进展溶解。2把溶好的buffer分装到的离心管中,1ml/管,常温放置。3使用前,每管参加30L巯基乙醇。考前须知:巯基乙醇为危险品,参加的过程在通风橱中完成,并且带好手套。五10PBS的配制: PBS10PBS1LNaH2PO4.2H2ONacl85gNa2HPO4.12H2O用去离子水将以上药品进展溶解。溶解的非常慢
6、,可能需要过夜调PH值到,用的滤膜过滤。常温保存。工作时用的是1PBS。六 Tris-Hcl (PH 8.8) 的配制: Tris-Hcl250mlTrisg 1 用200ml去离子水将Tris溶解。2用浓盐酸调PH值到。3调好PH的Tris-Hcl定容到250ml。4的滤膜过滤,常温保存。考前须知:Tris的缓冲能力很强,调PH值时,费些时间,但不要调过。七1M Tris-Hcl (PH 6.8) 的配制:1M Tris-Hcl250mlTris 1用200ml去离子水将Tris溶解。2用浓盐酸调PH值到3调好PH的Tris-Hcl定容到250ml。4的滤膜过滤,常温保存。八30%丙烯酰胺的
7、配制:30%丙烯酰胺250ml丙烯酰胺72.5 mlBIS甲叉丙烯酰胺2.5 ml1把药品用去离子水溶解后定容到250ml。2用滤纸过滤,放在棕色瓶子中,4保存。考前须知:两种药品有毒性,配制过程要带手套与口罩。九10%SDS的配制:11g SDS参加10ml去离子水进展溶解。2分装到离心管中,-20保存。十10%过硫酸铵的配制:11g 过硫酸铵参加10ml去离子水进展溶解。2分装到离心管中,-20保存。十一5SDS-PAGE电泳缓冲液的配制:5SDS-PAGE电泳缓冲液1LTrisGlycine甘氨酸94gSDS5g将以上药品用去离子水溶解后定容到1L,常温保存。工作时用的是1SDS-PAG
8、E电泳缓冲液。十二考马斯亮蓝R-250染色液的配制:考马斯亮蓝R-250染色液 1L 1 往1g考马斯亮蓝R-250中参加250ml异丙醇,在磁力搅拌器上搅拌六小时以上。2 参加650ml去离子水,磁力搅拌器搅拌过夜。3 再参加100ml冰醋酸进展溶解,磁力搅拌器搅拌。4 在通风橱内用滤纸进展过滤。常温保存。染色液只能反复用两次。考前须知:在磁力搅拌器上搅拌时,要把容器封口。十三脱色液的配制:脱色液1L醋酸冰乙酸100ml乙醇无水乙醇50ml去离子水850ml常温保存。四实验步骤: 一:质粒的转化 1使用无菌操作台之前先用75%的酒精擦拭,然后将灭菌的培养基以及所有要用到的器具放到超净台上,在
9、开紫外照射30min左右。操作之前,关掉紫外,翻开通风橱,将手用酒精擦拭后开场操作。2从-80的冰箱中取出表达菌BL21的感受态细胞每管100L,在-80冰水中融化。3载体PET32a等与基因片段的连接后质粒1L,缓慢的参加到100L BL21感受态中,冰置15min。无菌操作342下热激90s,随后在冰水中冰置5min。4涂板:先将涂布棒用酒精棉球擦,然后用酒精灯火焰烧,放置等它凉却。把处理后的感受态点在含有抗性的固体培养基氨苄或卡那等上。用冷却的涂布棒进展涂布,左手把该盖拿起,小指轻轻转动培养基,右手来涂,涂到培养基外表快干。无菌操作5放在37培养箱中,倒置培养过夜。考前须知:1质粒的转化
10、时,质粒是冻在-20的冰箱中,等它完全化了在进展吸取,往感受态中参加质粒时,一定要缓慢,因为感受态非常脆弱,防止感受态受伤。2质粒的转化时,热激的时间90s,一定要控制好时间。3质粒的转化时,涂布棒在涂布前,一定要晾凉涂布棒。防止感受态被烫死,或固体培养基的损坏。二:挑菌与接菌:1无菌操作台紫外线照射,后通风。将转化后的平板取出。2在无菌操作台中,把消毒后的螺口管一般一个基因取四个螺口管,进展平行实验取出,在酒精灯的外焰上灼烧螺口管管口。3灭菌后的LB培养基从冰箱中取出,在酒精灯的外焰上烧一下培养基瓶口。吸取LB培养基一般mL参加螺口管中,后参加抗性氨苄霉素、卡那等。氨苄霉素卡那:LB培养基=
11、1:1000L,抗性由载体决定。4镊子用酒精棉球擦拭,并在酒精灯的外焰上灼烧,将镊子晾凉。用晾凉的镊子,夹取20L小枪头,在转化后的平板上挑取单菌落,扔到培养基中。5接好菌的螺口管,进展摇菌。37,180rpm。摇到菌的对数期OD600值,时间大概2-3h。可以模糊看到手即可。注意不要摇过6用完的平板用封口膜封住,倒置放于4保存。7假设直接用菌液进展接菌,接菌比例为,菌液:LB培养基=1:100。考前须知:1 接菌吸培养基时,把放置培养基的三角瓶倾斜才吸取培养基,移液枪尽量不要插进三角瓶中。2接菌时一定要参加抗性,挑菌落时,要挑单个的菌落,且不要把培养基也扣起来。3摇菌不要过了它的对数期,2小
12、时后随时注意其生长状态。三小量保菌:1无菌操作台紫外线照射,后通风。2将摇到标准OD值的菌液进展小量保菌,先在酒精灯的外焰上灼烧螺口管管口。3保菌:从灭菌的饭盒中取出4个的灭菌的离心管,参加50L的灭菌后的80%的甘油,并分别参加相应的350L菌液。一个基因的四个平行实验菌都要进展保菌。假设不保菌,实验不能进展重复,只能从头做4标清保菌的类别,名称,时间,如“BL21 PET32a VAV 1号2021.”,其中的1号是平行对照中它排几号。5混匀,-20保存。考前须知:1在小量保菌中,一个基因的四个平行对照都要保菌,否那么得重新摸条件。2在小量保菌中,菌液与甘油一定要混匀在保存,否那么菌会被冻
13、死。四蛋白诱导表达条件摸索1无菌操作台紫外线照射,后通风。2小量保菌后的四个平行实验组,分别参加不同终浓度的IPTG,在不同的温度条件下进展诱导如下列图:对照编号IPTG终浓度诱导温度诱导温度1号1 mmol/L3h372号 mmol/L3h373号1 mmol/L3h304号 mmol/L3h30五小量收菌1将诱导完成的四个平行实验组菌液,分别取出1mL,对应装于4个不同的离心管中并做好标记。剩余的平行实验组菌液放入4保存。2离心7000rpm,2min,使菌沉淀。3把上层培养基倒掉,用1ml 1PBS把表达菌重悬,再次离心7000rpm,2min,使菌沉淀。4把上层1PBS倒掉,再次离心同
14、步骤3。5用80L 1PBS把表达菌体重悬。6在四个平行的重悬液中,分别参加80L 3SDS-PAGE loading buffer。把3SDS-PAGE loading buffer当成2SDS-PAGE loading buffer用7煮样8min。翻开锅盖煮8离心13000rpm,10min。吸上清。9进展SDS-PAGE电泳。考前须知:在煮样时要翻开锅盖煮,防止小样进水,假设样进水,那么不能再用。六SDS-PAGE胶的配制1别离胶的配制1找出配套的胶板,用擦镜纸擦干净,并固定在配胶器上。随后用去离子水试漏。2假设胶板不漏水,就进展别离胶的配制。依次将水、30%丙烯酰胺、 Tris-Hc
15、l、10%SDS、10%过硫酸铵加到干净的小烧杯中如下列图,混匀。1mm的胶板,一般配一块胶用5ml。所配的胶浓度一般为12%,但浓度也要视情况而定。蛋白越小,胶的浓度越大。3将胶板中的水倒掉,并用滤纸吸干水分不要将滤纸塞到胶板底部。4小烧杯中再参加TEMED,混匀。TEMED可使胶凝固,所以最后加5灌胶:混匀的别离胶沿着胶板边缘轻轻灌下,防止产生气泡。6用水将别离胶压平。用水灌满,同时加水时要缓慢参加,防止把胶吹起2浓缩胶的配制1待别离胶与水中间形成明显的横线,即别离胶凝固。随后进展浓缩胶的配制,依次将水、30%丙烯酰胺、 Tris-Hcl、10%SDS、10%过硫酸铵加到干净的小烧杯中如下
16、列图(2) 将别离胶上层的水倒掉,并用滤纸吸干水分。尽量不要把滤纸插入3小烧杯中再参加TEMED,混匀。 4灌胶。然后插入梳子。 5把制胶器倒过来,胶仍然不会往外流,或可以明显看出梳子中两个齿之间的胶面明显凹下去,说明浓缩胶凝固。将凝固的胶板装入电泳槽内,并在电泳槽内参加SDS-PAGE电泳缓冲液,把胶浸泡一段时间,时间越长越好。防止梳子与胶相连,或胶因湿度不够而萎缩6点样时,再把梳子拔出来,拔时动作要轻,防止胶齿被拔断。七未诱导与空载的制备在诱导表达中,有两个重要的对照组,即空载诱导与未诱导。1未诱导的制备1未诱导是我们所做一个基因除了四个平行实验外,再做的一个对照组菌,唯一不同的是它不进展
17、诱导接菌步骤如上,在37下,进展摇菌,不加IPTG,摇起来即可。与表达完的菌浓度差不多即可2未诱导的菌进展小量处理,见上面的小量收菌。2空载诱导的制备1空载的转化:将不连基因片段的空载体质粒,转入表达菌与前面的试验用一个表达菌,如“BL21-PET32a-VAV质粒转入“BL21表达菌,其空载应当是“BL21-PET32a转入“BL21表达菌。转化步骤同上。2空载接一个菌实验组,并摇菌摇到对数期步骤同上。3空载的诱导: 空载的诱导条件固定为温度37,时间3h. ,IPTG终浓度为1mmol/L。诱导步骤如上。4空载的菌进展小量处理,见上面的小量收菌。八蛋白诱导表达条件摸索的SDS-PAGE电泳
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- 诱导 表达
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