第3章--载体.ppt
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1、第第3 3章章-载体载体第一节第一节 克隆载体克隆载体克隆载体:克隆载体:用于携带用于携带DNA片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体克隆载体必备条件:克隆载体必备条件:具有对受体细胞的可转移性,能携带外源基因进入宿主细胞;具有对受体细胞的可转移性,能携带外源基因进入宿主细胞;能在宿主细胞中自主复制,或整合到宿主基因组中随其一起复能在宿主细胞中自主复制,或整合到宿主基因组中随其一起复 制,制,实现外源基因的增殖;实现外源基因的增殖;具有由单一限制性内切酶识别位点组成的多克隆位点,可供外源基因具有由单一限制性内切酶识别位点组成的多克隆位点,可供外源基因 插入;插
2、入;具有合适的选择标记,用于含有重组载体的宿主细胞筛选。具有合适的选择标记,用于含有重组载体的宿主细胞筛选。用于基因克隆的载体的类型:用于基因克隆的载体的类型:质粒载体(质粒载体(plasmid vector)噬菌体载体(噬菌体载体(phage vector)考斯质粒(考斯质粒(cosmid vector)人造染色体载体(人造染色体载体(artificial chromosome)一、一、质粒载体质粒载体 质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子;一类核酸分子;质粒常见于原核细菌和真菌中
3、;质粒常见于原核细菌和真菌中;绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是DNA型的;型的;绝大多数的天然绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构,即质粒具有共价、封闭、环状的分子结构,即cccDNA;质粒的分子范围:质粒的分子范围:1-200kb。野生型的质粒野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因,这使得上往往携带一个或多个遗传标记基因,这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状,包括:寄主生物产生正常生长非必需的附加性状,包括:物质抗性物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物;抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物;物质合成物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱。抗生素、
4、细菌毒素、有机碱。这些标记基因对这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。重组分子的筛选具有重要意义。(一一)质粒的基本性状质粒的基本性状1.复制复制质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统自主复制;复制系统自主复制;根据寄主每个细胞内分子数(拷贝数)多少,质粒可分为两大复制根据寄主每个细胞内分子数(拷贝数)多少,质粒可分为两大复制类型:类型:严谨型:严谨型:1-9拷贝拷贝松弛型:松弛型:10个以上个以上2.质粒的不相容性质粒的不相容性定义:指两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。定义:指两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。通常含有相同或相似复制子的质粒具有不相容性。
5、通常含有相同或相似复制子的质粒具有不相容性。3.质粒的转移性质粒的转移性接合型质粒:能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞接合型质粒:能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞(接合作用),如(接合作用),如F质粒等;质粒等;非接合型质粒:不能在天然条件下独立地发生接合作用。非接合型质粒:不能在天然条件下独立地发生接合作用。用于构建基因克隆载体的质粒一般是非接合质粒。用于构建基因克隆载体的质粒一般是非接合质粒。(二)质粒载体的构建(二)质粒载体的构建天然质粒载体不易直接作为克隆载体,需要改造:天然质粒载体不易直接作为克隆载体,需要改造:(1)选择合适的复制起始位点,)选择合适的复制
6、起始位点,松散型质粒复制起始位点;松散型质粒复制起始位点;(2)加入合适的选择标记基因,)加入合适的选择标记基因,主要有主要有LacZ基因和抗生素抗性基因;基因和抗生素抗性基因;(3)增加或减少酶切位点,)增加或减少酶切位点,组装多个单一的限制酶切位点即多克隆位点组装多个单一的限制酶切位点即多克隆位点 (MCS);(4)缩短长度,)缩短长度,通常重组通常重组DNA分子越小,转化效率越高。分子越小,转化效率越高。(三)常用的质粒载体(三)常用的质粒载体1.pBR322质粒载体质粒载体2.pUC18和和pUC19质粒载体质粒载体3.TA载体载体二、二、噬菌体载体噬菌体载体 1 噬菌体的性质噬菌体的
7、性质 外壳蛋白外壳蛋白 噬菌体噬菌体 线性,全长线性,全长48502bp DNA 5端含端含12bp的黏性末端的黏性末端(一)(一)噬菌体载体噬菌体载体2 噬菌体的构建噬菌体的构建a.噬菌体能够包装原噬菌体能够包装原DNA长度的长度的75%105%的的DNA片段片段(36.451kb)b.有有20kb的区域对的区域对噬菌体生长非必需。噬菌体生长非必需。构建构建 噬菌体的依据:噬菌体的依据:噬菌体载体的改造:噬菌体载体的改造:切除非必需区段,保证构建的切除非必需区段,保证构建的噬菌体载不小于噬菌体载不小于36.4kb,插入或替换外源基因后不大于插入或替换外源基因后不大于51kb;在在DNA分子的
8、合适区域插入可供筛选的标记基因:分子的合适区域插入可供筛选的标记基因:cI基因失活、基因失活、Spi筛选、筛选、Lac蓝白斑筛选蓝白斑筛选建立重组建立重组 DNA分子的体外包装系统。分子的体外包装系统。体外合成噬菌体外壳蛋白体外合成噬菌体外壳蛋白D和和E。5.5kb2.6kb4.9kb该该 噬菌体载体的最大装载容量为噬菌体载体的最大装载容量为:4.9+5.5+2.6+(51-48.5)=15.5kb3 代表性代表性 噬菌体噬菌体(1)插入型载体插入型载体装载容量为:装载容量为:0-10.18kb(2)置换型置换型噬菌体载体噬菌体载体载体载体克隆外源克隆外源DNA片段范围为:片段范围为:9-23
9、kb(二)(二)M13 M13 噬菌体载体噬菌体载体1.M13噬菌体的增值噬菌体的增值M13噬菌体是单链丝状噬菌体;噬菌体是单链丝状噬菌体;长长6407bp,507bp基因间隔区,含复制起始位点,同时可用于改造;基因间隔区,含复制起始位点,同时可用于改造;M13 DNA在宿主细胞中以双链或单链形式存在,但释放到细胞外的在宿主细胞中以双链或单链形式存在,但释放到细胞外的M13 噬菌体颗粒以单链形式存在。噬菌体颗粒以单链形式存在。2.M13噬菌体载体噬菌体载体1)插入选择标记基因;插入选择标记基因;2)组装合适的多克隆位点。组装合适的多克隆位点。三、三、噬菌体噬菌体-质粒杂合载体质粒杂合载体(一)
10、(一)黏粒载体黏粒载体噬菌体载体:承载容量大,但本身不能包装和增殖噬菌体载体:承载容量大,但本身不能包装和增殖质粒载体:易转化易复制,但承载外源质粒载体:易转化易复制,但承载外源DNA片段的容量小片段的容量小 cosmid可以进行有效包装和转导受体细胞,但由于不含可以进行有效包装和转导受体细胞,但由于不含有有噬菌体溶菌和溶原生噬菌体溶菌和溶原生长长途径,故不会途径,故不会产产生子代噬菌体。生子代噬菌体。DNA两端两端约约280bp序列包装相关序列序列包装相关序列Cosmid载体载体 包装范围为包装范围为36.451kb 质粒质粒DNA(E.Coli-ori,MCS,筛选标记等),筛选标记等)c
11、osmid(6.5kb)载体的装载容量:)载体的装载容量:29.944.5kb(二)(二)噬菌粒载体噬菌粒载体噬菌体噬菌体DNA间隔区(含间隔区(含M13 ori,颗粒形态发生所需的全部序列);,颗粒形态发生所需的全部序列);质粒所含的质粒所含的ori,筛选标记,多克隆位点,筛选标记,多克隆位点四、四、人工染色体及其应用人工染色体及其应用 定义定义:利用染色体的复制元件来驱动外源:利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体片段复制的载体 称为人工染色体。称为人工染色体。优点:优点:装载容量大。装载容量大。缺点:缺点:拷贝数少,制备困难拷贝数少,制备困难酵母人工染色体(酵母人工染色体(y
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