全长CDNA克隆方法.docx
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1、全长CDNA克隆方法以MITF基因为例,简述全长CDNA克隆的方法.方法分三步:1 .克隆中间片段2.克隆3,片段3.克隆5,片段,然后再将3者重复 序列删除,拼接起来.L中间序列克隆提取锦鲤的皮肤组织的mRNA,然后跑胶检测。如果有2根带,那么显示mRNA 提取成功.然后反转录成CDNA,检测B-actin。首先在NCBI上查找mitf基因,获取该基因的序列,CDS区,基因编号.并且保存, 以备以后比对序列用,选取斑马鱼的mitf a为模板.引物合成:用Primer 5设计a.引物长度:长度一般在18-30个碱基。一般都是18-24个左右。b. GC含量:一般引物GC含量为40%-60%,
2、一对引物的GC含量和TM值要协调。 如果引物存在严重的GC或者AT倾向,可以在引物最后加适当尾巴c.退火温度:退火温度需要比解链温度低5度。适当提高引物退火温度可以使 PCR的特异性增加。一般设计一对引物的TM值应该要比拟接近,一般在0-4 度以内,不会影响PCR的产率。温度在55-75度之间。d.防止扩增模板的二级结构区域,一对引物之间不应该存在4个连续碱基的同 源性或者互补性。选取时尽量选取分高的组合。设计引物时,尽量增加克隆的中间片段长度,为防止5 和3克隆出现长片段。引物设计好以后,根据引物的TM值,首先设计温度,做梯度PCR.比方TM为 65度,设计梯度时可以设计63,64,65,6
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