下一代测序技术简介.ppt
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1、Next Generation Sequencing(NGS)技术简介Sanger Sanger 测序测序Sanger 测序法仍然为基因测序行业内的金标准,但鸟枪测序法在技术上存在瓶颈。(价格昂贵、步骤繁琐、效率低)NGS=Next Generation SequencingNGS=Next Generation SequencingNGS也称为高通量测序High-throughput Sequencing(HTS)第一代测序:Sanger Sequencing(Sanger测序)第二代测序:NGS=Massively Parallel Sequencing(大规模平行测序)第三代测序:NGS
2、=HTS,SingleMolecule Sequencing(高通量、单分子测序)目前目前NGSNGS的主要三种测序仪器的主要三种测序仪器三种测序仪在高通量水平、测序准确度、存储格式和技术方法上均有差异。罗氏/454基因组测序仪FLX系统焦磷酸测序法光学230-400在第二代中最高读长;比第一代的测序通量大样品制备较难;难于处理重复和同种碱基多聚区域;试剂冲洗带来错误累积;仪器昂贵illuminaHiSeq2000/miSeq可逆链终止物和合成测序法荧光/光学2x150很高测序通量仪器昂贵;用于数据删节和分析的费用很高ABI/SOLiD5500 xlSOLiD系统连接测序法荧光/光学25-35
3、很高测序通量;在广为接受的几种第二代平台中,所要拼接出人类基因组的试剂成本最低测序运行时间长;读长短,造成成本高,数据分析困难和基因组拼接困难;仪器昂贵公司公司平台名平台名称称测序方法测序方法 检测方法检测方法大约读大约读长长(碱基碱基数数)优点优点相对局限性相对局限性三大测序平台的技术特点和差异三大测序平台的技术特点和差异Roche 454Roche 454测序原理测序原理Roche 454焦磷酸测序原理Roche 454Roche 454测序步骤测序步骤样品处理主要是针对大片段的DNA分子,如基因组DNA、Fosmid或BAC质粒等,利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化,然后采用琼脂糖
4、凝胶电泳回收或磁珠纯化,选择500-800bp的DNA片段。对于非编码RNA或PCR产物,则不需要这一步骤。一、样品处理一、样品处理Roche 454Roche 454测序步骤测序步骤二、文库制备二、文库制备文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步,454的文库接头分A、B两种,各44bp,由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp(TCAG)的“key”碱基构成,其中B接头的5端带有生物素(Biotin)标记,用于磁珠纯化步骤。Roche 454Roche 454测序步骤测序步骤三、连接微珠三、连接微珠将富集到的文库与测序磁珠、各反应物混合,加入特定的矿物油和表面活性剂,再利用振荡器剧烈振
5、荡,使反应体系形成油包水(water-in-oil)的稳定乳浊液。在理想条件下,每一个液滴,或称微反应器(microreactor)中将只包含一个磁珠和一条单链DNA,通过控制条件,1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。Roche 454Roche 454测序步骤测序步骤四、四、emRCRemRCRPCR扩增后,每一个磁珠上将形成密集的DNA簇,这些DNA序列完全相同,即可用于后续的步骤。乳液乳液PCRPCR(emRCRemRCR)Roche 454Roche 454测序步骤测序步骤五、反应板准备、上机测序五、反应板准备、上机测序454测序的反应板称为PTP(Pico Tite
6、r Plate),含有350万个由光纤组成的小孔,每个孔的直径为29m,而测序磁珠的直径为20m,因此每个孔中仅能容纳一个磁珠。Roche 454Roche 454测序步骤测序步骤六、测序和分析六、测序和分析将磁珠与测序试剂加入PTP中,使之可用于上机测序。在454测序仪中,A、T、G、C四种碱基是分别存储在单独的试剂瓶中的,每步反应四种碱基依次加入反应池,当碱基配对结合,就会释放出一个焦磷酸(PPi),而这个焦磷酸在酶的作用下,将荧光素氧化成氧化荧光素,并发出光信号,从而读取出这一位置的碱基信息。IlluminaIllumina测序原理测序原理Illumina合成测序原理IlluminaIl
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