毛细管凝胶电泳.ppt
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1、 毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis)讲解人:操兰学号:2015110239Contents1 发展简史发展简史2 毛细管凝胶电泳的原理毛细管凝胶电泳的原理3 毛细管凝胶柱的制备技术毛细管凝胶柱的制备技术4 现有交联现有交联凝胶凝胶柱制备技术柱制备技术5 凝胶缺陷的形成原因和避免措施凝胶缺陷的形成原因和避免措施6 毛细管凝胶电泳的应用毛细管凝胶电泳的应用7 CGE 技术的问题与展望技术的问题与展望8 相关文献相关文献一、发展简介1.早在六十年代,Hjerten就尝试过毛细管电泳技术,在七十年代 Virtanen和 Mikkers等人 也进行过研究。由于受
2、到检测器灵敏度的限制,不能用细内径的毛细管,电泳过程中产生的焦耳热不能很好地散失,以致限制了高电压的运用,严重影响了分离效率。2.七十年代末,毛细管技术的广泛应用,使得人们加快了对细管电泳的研究。1951年,Jorgensen等人改善了检测器的灵敏度,可以使用75um 内径的玻璃毛细管,并采用了30kV的高压,获得了很高的效率(N=4x105s)。他们对毛细管电泳分离理论的研究以 及柱效方程的推导,对毛细管电泳技术的发展起了巨大的推动作用。3.1983年hierten首次将传统凝胶电泳技术中的聚丙烯酞凝胶装入150um 的玻璃毛细管,以消除毛细管内壁对蛋白质的吸附,并利用这种方法对多种蛋白质进
3、行了分离,取得了很好的分离效果。1957年,oChen 和Karger使用了100um 内径以下的弹性石英毛细管,用同管内壁交联的方法制备凝胶柱,分离了蛋白质、DNA和寡聚核昔酸。4.1990 年,Lux和Yin 等人对 oChen和Karger柱制备技术进行了改进,提出了用线性聚丙烯酞胺对柱内表面预处理和用射线引发聚合的方法,在分离DNA内切片段和寡聚核昔酸时取得极好的效率。二、基本原理毛细管凝胶电泳(CGE)是毛细管电泳的几种操作模式之一,特别适于分离蛋白质、核酸片段等生物大分子,具有分离能力强、速度快等特点。毛细管凝胶电泳,是将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性,起
4、类似分子筛的作用,溶质按分子大小逐一分离。凝胶粘度大,能减少溶质的扩散,所得峰形尖锐,能达到最高的柱效。常用聚丙烯酞胺在毛细管内交联制成凝胶柱,可分离测定蛋白质和的分子量或碱基数,但其制备麻烦,使用寿命短。如采用粘度低的线性聚合物如甲基纤维素代替聚丙烯酞胺,可形成无凝胶但有筛分作用的无胶筛分介质,它能避免空泡形成,比凝胶柱制备简单,寿命长,但分离能力比凝胶柱略差。22毛细管凝胶电泳 用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质,网状结构,按分子的体积大小和组用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质,网状结构,按分子的体积大小和组分的质荷比来进行分离分的质荷比来进行分离 ,大分子出来的快,小分子出来的慢。大分子出来
5、的快,小分子出来的慢。聚丙烯酰胺凝胶(PAG):以丙烯酰胺为单体,甲叉双丙烯酰胺作为交联剂,由过硫酸铵与四甲基乙二胺为氧化还原反应产生的自由基催化聚合而成。PAG的孔径一般在330nm左右,适合分离核酸片段结构。琼脂糖凝胶(AG):由琼脂糖在氢键作用下结合而成,孔径大,常用来分离蛋白质分子和大的DNA片段。凝胶的种类凝胶的种类CH2=CHCONH2CH2=CHC=ONHCH2NHCH2=CHC=O丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺毛细管凝胶电泳综合了电泳技术和平板凝胶电泳的毛细管凝胶电泳综合了电泳技术和平板凝胶电泳的优点优点:1.1.电泳峰电泳峰尖锐,柱效极高尖锐,柱效极高2.2.短柱上实现极好的分离短柱
6、上实现极好的分离3.3.试样容量为试样容量为10101212g g主要缺点主要缺点:制备柱较困难,寿命较短。制备柱较困难,寿命较短。已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核 酸、酸、DNADNA等强有力的工等强有力的工具。例应用具。例应用CGECGE分离与激光诱导荧光检测相结合,用于分离与激光诱导荧光检测相结合,用于DNADNA序列快速分析。序列快速分析。222 分离模分离模毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳三、毛细管凝胶柱制备技术毛细管凝胶柱的性能指标毛细管凝胶柱的性能指标(1)柱稳定性(即柱寿命),这是评价毛细管凝胶柱的一个重要指标,各种柱制备方法都力
7、求提高柱稳定性,没有高的稳定性,就没有迁移时间和峰面积的高度重现性;(2)柱分离效率;(3)迁移时间的重现性(在DNA 序列分析中尤其重要)。在毛细管中制备聚丙烯酰胺凝胶通常包括以下几步操作在毛细管中制备聚丙烯酰胺凝胶通常包括以下几步操作:(1)毛细管内壁的处理a)用有机溶剂、碱液、水清洗毛细管内壁;b)在毛细管内壁键合双官能团试剂(如MAPS);c)使双官能团试剂与单体聚合形成一层聚合物薄膜。根据需要,有时可以省去操作 c 或者操作 b和 c。(2)预聚溶液的准备(包括过滤、脱气、引发剂的加入);(3)将预聚溶液导入毛细管;(4)使预聚溶液在毛细管中聚合;四、现有的交联凝胶柱制备技术四、现有
8、的交联凝胶柱制备技术(1)Y.Baba 法毛细管只用上节中操作(1)a 进行预处理,催化剂和引发剂浓度较低,柱中凝胶预聚溶液在比较温和的条件下聚合,此法制得的柱子稳定性较差,但在较低的场强下可以使用 50 多次,而且制备方法简单,成功率较高,可以弥补稳定性方面的不足。(2)B.L.Karger 法毛细管依次用操作(1)a,b 进行处理,当凝胶预聚溶液在管内聚合时,内表面上的双官能团试剂与凝胶聚合在一起。这一类凝胶柱的稳定性很高,报导过使用的最高记录达 200 多次,并能忍受较高的场强。但是先键合在管壁上的双官能团试剂的烯烃双键参与了凝胶形成,使得聚合过程中溶液流动性变差,不利于未反应溶液去填补
9、体积收缩;另一方面,内表面处理过的毛细管疏水性增加,润湿性下降,在充入预聚溶液时,本体溶液与管壁间可能存在极薄的间隙。这两种因素都增加了聚合过程中形成凝胶缺陷的机会。(3)HP(惠普公司)专利方法这一方法的特点是对正在聚合的凝胶溶液施加高压,使其体积收缩,收缩的程度与其聚合后体积收缩的程度相匹配。这种方法使用的压力最少需要 120 个大气压,而且凝胶 T 值越大,所要求的压力也越高。(4)H.F.Yin(尹红峰)法毛细管依次用操作(1)a,b,c 进行处理,使管内壁覆盖一层线性聚合物涂层,增加了管内壁的浸润性,双官能团试剂不再参与聚合反应,配合使用高压,减少了凝胶缺陷的产生,同时也极大地减小了
10、电渗流,柱稳定性相对提高。用这种方法制备的柱子,分离能力很强,对 400 多碱基数的核苷酸片段达到单碱基差异分离。但这一方法并没有得到广泛应用,可能是步骤较多,重复性较差。(5)J.A.Lux 法这一方法的特点是以 C 射线引发聚合反应,避免 APS2TEMED引发剂体系产生的荷电副产物对凝胶结构的损害,反应可以控制在较温和的条件下进行,而且一次可以制备多根毛细管凝胶柱,但推广起来受辐射源的限制。(6)T.Wang 法这一方法采用核黄素2TEMED 体系作引发剂,在紫外光的照射下进行游离基聚合反应,毛细管置于冰水浴中,聚合以较温和的方式进行,据报导,成功率在80%以上,而且可以避免APS2TE
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