HPLC应用-mm.ppt
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1、高效液相色谱(高效液相色谱(HPLC)知识)知识实验室内部交流资料2009年11月HPLC系统lHPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。l高压输液泵高压输液泵l为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相(为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相(10m),液),液体的流动相高速通过时,将产生很高的压力,因此高压、体的流动相高速通过时,将产生很高的压力,因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。高速是高效液相色谱的特点之一。l应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性输液泵的使
2、用和维护使用注意事项l防止任何固体微粒进入泵体,因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀,因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内储存,而常用的方法是滤过,可采用Millipore滤膜(0.2µm或0.45µm)等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒(或片)。输液泵的滤器应经常清洗或更换。l输液泵的使用和维护l流动相不应含有任何腐蚀性物质,含有缓冲液的流动相不应保留在泵内,尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内,由于蒸发或泄漏,甚至只是由于溶液的静置,就可能析出盐的微细晶体,这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封
3、环和柱塞等。因此,必须泵入纯水将泵充分清洗后,再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂(对于反相键合硅胶固定相,可以是甲醇或甲醇-水)。l输液泵的使用和维护l泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完,否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环,最终产生漏液。l输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力,否则会使高压密封环变形,产生漏液。l流动相应该先脱气,以免在泵内产生气泡,影响流量的稳定性,如果有大量气泡,泵就无法正常工作。输液泵的使用和维护故障排除:l没有流动相流出,又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体,这时可打开泄压阀,使泵在较大流量(如5ml/min)下运转,将气泡排尽,也可用一个50m
4、l针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损,需更换。l压力过高的原因是管路被堵塞,需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段进行。输液泵的使用和维护l压力和流量不稳。a.气泡,需要排除b.单向阀内有异物可卸下单向阀,浸入丙酮内超声清洗。c.砂滤棒内有气泡,或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞,可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡,或将砂滤棒浸入稀酸(如4mol/L硝酸)内迅速除去微生物,或将盐溶解,再立即清洗。输液泵的使用和维护梯度洗脱的注意事项l要注意溶剂的互溶性,不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶,超出范围后就不互溶
5、,使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时,还可能析出盐的晶体,尤其使用磷酸盐时需特别小心。l梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高,以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱,以辨认溶剂杂质峰,因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气,以防止混合时产生气泡。输液泵的使用和维护l混合溶剂的粘度常随组成而变化,因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小,当二者以相近比例混合时粘度增大很多,此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。进样器六通阀进样自动进样l六通阀的进
6、样方式有部分装液法和完全装液法两种。l用部分装液法进样时,进样量应不大于定量环体积的50%(最多75),并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度,而且易产生由进样引起的峰展宽。l用完全装液法进样时,进样量应不小于定量环体积的510倍(最少3倍),这样才能完全置换定量环内的流动相,消除管壁效应,确保进样的准确度及重复性。进样阀六通阀使用和维护注意事项:l样品溶液进样前必须用0.45µm滤膜过滤,以减少微粒对进样阀的磨损。l转动阀芯时不能太慢,更不能停留在中间位置,否则流动相受阻,使泵内压力剧增,甚至超过泵的最大压力;再转到进样位时,过高的压力将
7、使柱头损坏。l为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中,每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗,或先用能溶解样品的溶剂冲洗,再用水冲洗。l自动进样l解决自动进样器残留的关键在于选择合适的进样针清洗溶剂,好的洗针溶剂应对样品具有良好的溶解性,这样才能最大限度得减少样品残留。一般来说用甲醇-水作为洗针溶剂可以解决大多数的RP-HPLC分析的洗针问题,至于甲醇-水的比例就由你的分析方法而定。有的时候如果样品的溶解度受pH的影响较大的还需要调整洗针液的pH值。色谱柱的使用及维护1、色谱柱的使用说明:、色谱柱的使用说明:(1)、色谱柱使用前注意事项:色谱柱的储存液无特殊说明,均为评价报告所示的流动相。在使用
8、前,一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中,如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂,应先用1020倍柱体积10左右甲醇/水的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下,否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出,堵塞色谱柱。3.14*(0.23cm)2*20cm*10倍/1(min/ml)=33.2min(4.6mm200mm)3.14*(0.23cm)2*25cm*10倍/1(min/ml)=41.5min(4.6mm250mm)(2)、流动相:流动相:有机溶剂色谱纯水超纯水或全玻璃器皿的双蒸水(娃哈哈)用0.45m的滤膜过滤以常规硅胶为基质的键合相的PH值2.0-8.0BDSC18
9、(碱性灭活硅胶柱)PH值适用范围为2.0-10.0(3)、样品:样品:样品也要尽可能清洁,可选用样品过滤器或样品预处理柱(SPE)对样品进行预处理;若样品不便处理,要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时,所有的溶剂和样品应严格脱水。l2、色谱柱的保存、色谱柱的保存(1)、反相色谱柱每天实验后的保养:使用缓冲液或含盐的流动相,实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟,洗掉色谱柱中的盐,再用甲醇冲洗。注意:不能用纯水冲洗柱子,应该在水中加入10%的甲醇,防止将填料冲塌陷。l(2)、长期保存色谱柱:如色谱柱要长时间保存,必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中,正相柱可以储存于严格
10、脱水后的纯正己烷中,并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。l3、色谱柱的再生、色谱柱的再生 因为色谱柱是消耗品,随着使用时间或进样次数的增加,会出现色谱峰高降低,峰宽加大或出现肩峰的现象,一般来说可能是柱效下降。(1)、反相柱的再生:依次采用20-30倍的色谱柱体积的甲醇:水=10:90(V/V),乙腈,异丙醇作为流动相冲洗色谱柱,完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。(2)、正相柱的再生:依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱,然后再以相反的顺序冲洗。要注意溶剂必须严格脱水。l4、色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办、色谱柱在使用过程中
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