多抗制备.ppt
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1、多克隆抗体的制备及抗体效价测定 目的要求目的要求掌握多克隆抗体制备的基本原理。掌握多克隆抗体制备的基本原理。掌握多克隆抗体制备的操作步骤。掌握多克隆抗体制备的操作步骤。掌握肥达反应的实验原理、操作流程和结果判掌握肥达反应的实验原理、操作流程和结果判断。断。熟悉熟悉ELISA的实验原理、操作流程和结果判断。的实验原理、操作流程和结果判断。了解细菌抗原和病毒抗原免疫程序上的异同。了解细菌抗原和病毒抗原免疫程序上的异同。了解免疫动物的选择原则。了解免疫动物的选择原则。原理1、克隆克隆(clone):是指无性繁殖细胞系,是由单一是指无性繁殖细胞系,是由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在个祖
2、先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中,如无突变发生,其基因这个家族的所有成员中,如无突变发生,其基因是完全相同的。是完全相同的。2、多克隆抗体(、多克隆抗体(polyclonal antibody,pAb):用):用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物,可刺一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物,可刺激机体激机体多个多个B细胞克隆细胞克隆产生针对产生针对多种抗原表位多种抗原表位的的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种多种抗体的混合物,即多克隆抗体抗体的混合物,即多克隆抗体。3、单克隆抗体(、单克隆抗体(monoclonal ant
3、ibodies,mAb):由一个):由一个识别一种抗原表位识别一种抗原表位的的B细胞细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。强、效价高、少或无交叉反应性。抗体的制备技术经历了三代抗体的制备技术经历了三代:第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体,称为多克隆抗抗原免疫动物后获得抗体,称为多克隆抗体(体(polyclonal antibody););第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗原中某一抗原决定簇的抗
4、体称为单克隆抗体抗体(monoclonal antibody,McAb);第三代抗体是利用基因工程技术制备而来,第三代抗体是利用基因工程技术制备而来,称为基因工程抗体称为基因工程抗体(genetic engineering antibody)。Ab1Ab3Ab4单克隆抗体单克隆抗体抗原抗原Ab1抗血清抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清(多克隆抗体)普通抗血清(多克隆抗体)脾脾B细细胞胞骨髓瘤小鼠骨髓瘤小鼠取腹水取腹水骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞HAT培养,培养,稀释稀释单单克克隆隆抗抗体体和和多多克克隆隆抗抗体体产产生生区区别别示示意意图图杂交瘤细胞杂交瘤细胞+PEG,融合融合
5、Ab2 多克隆抗体制备流程多克隆抗体制备流程(一)免疫原的制备(一)免疫原的制备(二)免疫动物(二)免疫动物(三)免疫血清的收集(三)免疫血清的收集(四)免疫血清的鉴定(四)免疫血清的鉴定(五)免疫血清的保存(五)免疫血清的保存操作步骤操作步骤一、免疫原的制备一、免疫原的制备免疫原免疫原(immunogen)指能刺激机体免疫)指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最重要的性质是原最重要的性质是免疫原性免疫原性(immunogenicity)免疫原免疫原天然抗原、人工天然抗原、人工 合成抗原;合成抗原;蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原;蛋白质、多糖
6、、脂类、核酸抗原;(一)细胞性抗原制备:(一)细胞性抗原制备:绵羊红细胞(绵羊红细胞(SRBC)-溶血素;溶血素;细菌细菌-抗菌抗体(动物免疫血清)抗菌抗体(动物免疫血清)(二)可溶性抗原制备:(二)可溶性抗原制备:指蛋白质、多糖和脂类等。指蛋白质、多糖和脂类等。1)细胞的破碎(物理法、化学法)细胞的破碎(物理法、化学法)反复冻融法反复冻融法超声破碎法超声破碎法自溶法自溶法酶处里法酶处里法表面活性剂处理法表面活性剂处理法2)提取与纯化:)提取与纯化:超速离心分离超速离心分离是一种根据分离物质的是一种根据分离物质的比重特点,通过差速或梯度密度离心,比重特点,通过差速或梯度密度离心,将分子大小不同
7、的抗原颗粒分开的方法,将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法,只适宜少数大分子物质的分离。只适宜少数大分子物质的分离。选择性沉淀选择性沉淀选择某抗原理化特性,采用相应沉选择某抗原理化特性,采用相应沉淀剂或溶液环境。淀剂或溶液环境。核酸去除核酸去除 盐析沉淀法盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法高分子聚合物沉淀法例:例:50%50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋;饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋;8%8%12%PEG600012%PEG6000可沉淀可沉淀IgGIgG。盐析法沉淀抗原的机理盐析法沉淀抗原的机理 超滤法超滤法利用孔径大小不同的特制薄膜对利用孔径大小不同的特
8、制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛。不同分子大小的抗原物质进行滤筛。层析法层析法 凝胶过滤凝胶过滤 离子交换离子交换 亲和层析亲和层析电泳电泳(略)(略)凝胶过滤层析凝胶过滤层析(分子筛分子筛)的作用机理的作用机理 亲和层析的作用机理亲和层析的作用机理3)鉴定:)鉴定:鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及免疫学活性。纯度以及免疫学活性。蛋白的含量蛋白的含量定氮(紫外光定氮(紫外光280nm等)等)分子的质量分子的质量电泳、质谱电泳、质谱蛋白的纯度蛋白的纯度电泳等电泳等免疫学活性免疫学活性免疫双扩散、免疫印迹免疫双扩散、免疫印迹 抗原性质分析结果抗
9、原性质分析结果(三)半抗原性免疫原的制备(三)半抗原性免疫原的制备1.载体选择载体选择常用载体:蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。常用载体:蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。(1)蛋白质类:常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋)蛋白质类:常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等,其中以牛血清白蛋白最为常用。白、血蛋白等,其中以牛血清白蛋白最为常用。(2)多肽类聚合物:是由人工合成的多肽聚合物,也)多肽类聚合物:是由人工合成的多肽聚合物,也是一类良好的载体,常用的有多聚赖氨酸。是一类良好的载体,常用的有多聚赖氨酸。(3)大分子聚合物:聚乙烯吡咯烷酮()大分子聚合物:聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲
10、)、羧甲基纤维素基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合,加入福氏完全等皆可与半抗原结合,加入福氏完全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。佐剂可诱导动物产生良好的抗体。2.连接方法连接方法 半抗原与载体的连接有物理法和化学法。半抗原与载体的连接有物理法和化学法。物理法物理法 是用物理吸附法将载体与半抗原连是用物理吸附法将载体与半抗原连接,其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原,接,其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原,吸附载体主要有吸附载体主要有PVP和和CMC等;等;化学法化学法 是利用某些功能基团把半抗原连接是利用某些功能基团把半抗原连接到白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半到白质类或多肽类聚合物载体上。不同
11、的半抗原应选用不同的方法进行连接。抗原应选用不同的方法进行连接。根据半抗原拥有的化学基团不同,连接方法根据半抗原拥有的化学基团不同,连接方法主要有以下几类:主要有以下几类:带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原:带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原:羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键,带氨基的半抗原则可与载体形成稳定的肽键,带氨基的半抗原则可与载体羧基缩合。羧基缩合。带有羟基、酮基、醛基的半抗原:不能直接与带有羟基、酮基、醛基的半抗原:不能直接与载体连接,需要用化学方法如琥珀酸酐法、载体连接,需要用化学方法如琥珀酸酐法、O-(羧
12、甲基)羟胺法等方法将之转变为带有羧基(羧甲基)羟胺法等方法将之转变为带有羧基的半抗原衍生物后才能与载体连接。的半抗原衍生物后才能与载体连接。带有酚基的半抗原,可用一氯醋酸钠法或重氮带有酚基的半抗原,可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法,生成带有羧基的半抗原化的对氨基苯甲酸法,生成带有羧基的半抗原衍生物。衍生物。(四)免疫佐剂(四)免疫佐剂某些物质与抗原一起或先于抗原注入某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体,可机体,可增强机体对该抗原的特异性增强机体对该抗原的特异性免疫应答免疫应答或或改变免疫应答类型改变免疫应答类型,此类,此类物质称为免疫佐剂物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)
13、,简称佐剂。,简称佐剂。1.佐剂的种类佐剂的种类 佐剂一般包括以下几类:佐剂一般包括以下几类:无机佐剂:无机佐剂:如氢氧化铝、明钒等如氢氧化铝、明钒等生物性佐剂:生物性佐剂:如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等;亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等;人工合成佐剂:人工合成佐剂:如双链多聚肌苷酸:胞苷酸(如双链多聚肌苷酸:胞苷酸(poly I:C)、双链多聚腺苷酸:尿苷酸()、双链多聚腺苷酸:尿苷酸(poly A:U););油剂:如弗氏完全佐剂、花生油
14、乳剂等;油剂:如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等;纳米佐剂纳米佐剂 弗氏佐剂(弗氏佐剂(Freunds adjuvant),分分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种:为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种:前者是由油剂(矿物油或花生油)和乳化前者是由油剂(矿物油或花生油)和乳化剂(羊毛脂或吐温剂(羊毛脂或吐温-80)按)按1:11:5比例比例混合而成;混合而成;后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时,先将弗氏佐剂与抗原等比混免疫动物时,先将弗氏佐剂与抗原等比混匀,制成匀,制成“油包水油包水”乳化液。乳化液。佐剂与抗原混合乳化的方法:佐剂与抗原混合乳化的方法:研磨法研磨法
15、搅拌混合法搅拌混合法 2.佐剂的免疫生物学作用佐剂的免疫生物学作用增强抗原免疫原性:使无或微弱免疫原性的增强抗原免疫原性:使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原;物质变成持久或强的免疫原;增强机体对抗原刺激的反应性,提高初次应增强机体对抗原刺激的反应性,提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度;答和再次应答所产生的抗体滴度;改变抗体类型,使产生抗体由改变抗体类型,使产生抗体由IgMG型转变型转变为为IgG型;型;引起或增强迟发性超敏反应。引起或增强迟发性超敏反应。3.佐剂的作用机制佐剂的作用机制 佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种:佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种:可增强抗原的表面积
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