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1、实验二实验二 DNA的酶解的酶解一、原理一、原理n 所谓DNA酶解就是DNA被限制性内切酶切成大小不等的片段。可用于Southern分析或DNA体外重组等实验n限制性内切酶:共有三类,但只有第类识别位点和切点在相同部位,因而是实用的,这类内切酶通常识别DNA中46个核苷酸的顺序,识别的顺序为二重对称。酶解产生的DNA片段末尾可以是平齐末端(如Hae)或粘性末端(如EcoR I)。限制性内切酶(限制性内切酶(restriction restriction endonucleaseendonuclease)uu是一类能识别和切割双链是一类能识别和切割双链DNADNA分子分子 中特定碱基顺序的核酸水
2、解酶中特定碱基顺序的核酸水解酶uu识别的识别的 DNADNA序列多为序列多为4-64-6个碱基个碱基uu识别的序列都具有回文结构识别的序列都具有回文结构uu切割后产生平齐末端和粘性末端切割后产生平齐末端和粘性末端HpaHpaI I 5GTTAAC 3 5GTTAAC 3 3CAATTG 5 3CAATTG 5 5GTT AAC 3 5GTT AAC 3 3CAA TTG 5 3CAA TTG 5 e.g.Hind I Hind II Hind III (流感嗜血杆菌中三个酶 Haemophilus influenzaed)第一个字母(大写、斜体)该酶的微生物属名第二、三个字母(小写、斜体)代表
3、微生物种名第四个字母(斜体)代表寄主菌的株或型用罗马数码I、II、III等区分同一株具 有不同特异性的酶u 命名命名:应用:外源基因与载体的连接 (DNA连接酶)u粘性末端连接粘性末端连接u同一限制性内切酶位点连接同一限制性内切酶位点连接u不同限制性内切酶位点连接不同限制性内切酶位点连接u平端连接平端连接u同聚物加尾连接同聚物加尾连接u人工接头连接人工接头连接(1)互补粘端DNA或切口间的连接 5 ACGOH pAATTCGT 3 3 TGCTTAAp HOGCA 5 ATP、Mg2+T4连接酶 5 ACGAATTCGT 3 3 TGCTTAAGCA 5u反应例解:(2)平端连接5 C G A
4、OH pC G T A 33 G C Tp OHG C A T 5 ATP、Mg2+T4连接酶 5 CGACGTA 3 3 GCTGCAT 5n酶单位定义:在最适温度,最适pH条件下,一小时完全水解1g噬菌体DNA所需的酶量定为1个单位(u)。二、方法n1取0.1glDNA溶液10l于一干净的0.5ml Eppendorf管中。n2加10Hind酶解缓冲液2l,0.4u/l Hind 5l,双蒸水3l,使反应总体积20l,充分混匀。n 3在37水浴中保温2hr,保温结束后加2l终止液,混匀。n 4电泳观察酶解结果。酶解体系酶解体系加入物质加入物质体积体积作用作用0.10.1 g g l l D
5、NADNA1010 l l噬菌体噬菌体DNADNA1010HindHind酶解缓冲液酶解缓冲液2 2 l l维持维持pHpH值,离子强度值,离子强度0.4u/0.4u/l Hindl Hind5 5 l l限制性内切酶限制性内切酶双蒸水双蒸水3 3 l l补足体积,达到一定浓度补足体积,达到一定浓度充分混匀充分混匀,3737水浴中保温水浴中保温1hr1hr终止液终止液(EDTA/(EDTA/甘油甘油/溴酚兰溴酚兰)2 2 l l三、注意事项n1限制性内切酶较昂贵,且极易失活,要特别注意酶活力的保存,酶保存缓冲液一般有10mmol/LTris-HCl(pH7.4),50100mmol/L NaCl或KCl,lmmol/L DTT,100200gml BSA(保持蛋白浓度,使酶稳定),50甘油(存于-20不结冰,结冰反复解冻使酶失活)n2限制性内切酶用量极少,必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中n3注意酶切时加样次序:水、缓冲液、DNA、最后才加酶 取液时,Tip要从溶液表面吸,以防Tip沾去过多酶,待用的内切酶要放在冰浴内,用后盖紧盖子,立即放回20冰箱,防止限制性内切酶的失活n4凡用在酶切反应中的一切塑料器皿,都要净水清洗,湿热灭菌,镊子夹取,不直接用手去拿,以防手上杂酶污染
限制150内