细胞生物学-细胞调亡.ppt
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1、一、一、凋亡概念的形成:凋亡概念的形成:1965年年澳澳大大利利亚亚科科学学家家Kerr发发现现,结结扎扎鼠鼠门门静静脉脉后后,电电镜镜观观察察到到肝肝实实质质组组织织中中有有一一些些散散在在的的死死亡亡细细胞胞,这这些些细细胞胞体体积积收收缩缩、染染色色质质凝凝集集从从其其周周围围的的组组织织中中脱脱落落并并被被吞吞噬噬,机机体体无无炎炎症症反反应应。1972年年Kerr提提出出了了细细胞胞凋凋亡亡的的概概念念,宣宣告告了了对对细细胞胞凋凋亡亡的的真真正正探探索索的的开开始始,在在此此之之前前,关关于于胚胚胎胎发发育育生生物物学学、免免疫疫系系统统的的研研究究,肝肝细细胞胞死死亡亡的的研研究
2、究都都为为这这一一概概念的提出奠定了基础。念的提出奠定了基础。细胞凋亡定定义义:是是指指为为维维持持内内环环境境稳稳定定,由由基基因因控控制制的的细细胞胞自自主主的的有序的结束生命的过程。有序的结束生命的过程。细胞凋亡细胞凋亡(Apoptosis)蝌蚪向蛙发育的变态反应蝌蚪向蛙发育的变态反应发育过程中手和足的成形过程发育过程中手和足的成形过程发育中神经细胞数量的调节发育中神经细胞数量的调节诱导细胞调亡的因子诱导细胞调亡的因子物物理理性性因因子子,包包括括射射线线(紫紫外外线线,射射线线等等),较较温和的温度刺激(如热激,冷激)等温和的温度刺激(如热激,冷激)等 化化学学及及生生物物因因子子:包
3、包括括活活性性氧氧基基团团和和分分子子,DNA和和蛋蛋白白质质合合成成的的抑抑制制剂剂,激激素素,细细胞胞生生长长因因子子,肿肿瘤瘤坏坏死死因因子子(TNF),抗),抗Fas/Apo-1/CD95抗体等抗体等。细胞凋亡细胞凋亡形态变化形态变化特征特征(1 1)凋亡的起始;微绒毛的)凋亡的起始;微绒毛的消失,细胞间接触的消失,与消失,细胞间接触的消失,与周围的细胞脱离,染色质固缩周围的细胞脱离,染色质固缩.沿着核膜分布。沿着核膜分布。(2 2)凋亡小体的形成。核膜)凋亡小体的形成。核膜核仁破碎,核染色质断裂为大核仁破碎,核染色质断裂为大小不等的片段,与某些细胞器小不等的片段,与某些细胞器如线粒体
4、一起聚集,为反折的如线粒体一起聚集,为反折的细胞膜所包围。细胞膜所包围。(3 3)凋亡小体逐渐被周围专)凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。职或非专职吞噬细胞吞噬。A、Normal cell B、Apoptosis:Apoptotic bodies胸腺细胞胸腺细胞正常正常凋亡 是是细细胞受到化学因素(如胞受到化学因素(如强强酸、酸、强强碱、有毒物碱、有毒物质质)、物理因素(如、物理因素(如热热、辐辐射)和生物因素(如病原体)等射)和生物因素(如病原体)等环环境因素的境因素的伤伤害,引起害,引起细细胞死亡的胞死亡的现现象。象。细胞坏死细胞坏死早期表现为细胞膜破坏,线粒体肿胀。早期表现为细
5、胞膜破坏,线粒体肿胀。继而溶酶体破裂继而溶酶体破裂,细胞内容物流出细胞内容物流出,引起炎症。引起炎症。细胞凋亡与细胞凋亡与坏死坏死(necrosis)ApoptosisNecrosisDeath by apoptosis is a neat,orderly process细胞凋亡与坏死的区别细胞凋亡与坏死的区别胞浆内胞浆内CaCa2+2+浓度升高。浓度升高。DNADNA内内切切酶酶活活性性被被激激活活升升高高,双双链链DNADNA在在核核小小体体之之间间切切断断形形成成180200bp特征性的特征性的DNA ladders 。细胞凋亡的生化特征细胞凋亡的生化特征Apoptosis induce
6、d by Cyto CLane 10 h 21 h 32 h 43 h 54 h 6Control 7Marker 凋亡细胞凋亡细胞 tTG(组织转谷氨酰胺酶(组织转谷氨酰胺酶)积累并达到较高水平)积累并达到较高水平形态学观测:染色法、透射和扫描电镜观察形态学观测:染色法、透射和扫描电镜观察细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测Nuclear morphological changes of HeLa cells in apoptosis process (488nm 400)电镜观察电镜观察 凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩,核内染色质高凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩,核内染色质高度盘绕,出现许多空泡结构。
7、细胞凋亡的晚期,细胞核裂解度盘绕,出现许多空泡结构。细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。为碎块,产生凋亡小体。磷脂酰丝氨酸磷脂酰丝氨酸正常位于细胞膜的内侧,在凋亡早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能专一性的结合暴露在膜外侧的PS。将Annexin-V进行荧光素(FITC)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。磷脂酰丝氨酸磷脂酰丝氨酸(PhosphatidylserinePhosphatidylserine PS PS)
8、外翻分析外翻分析(Annexin VAnnexin V法)法)Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinVDNADNA片段化分析片段化分析 细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩,染色质染色质DNADNA在核小体单位之间的连接处断裂在核小体单位之间的连接处断裂,形成形成180180 200bp200bp整数倍的寡核苷整数倍的寡核苷酸片段酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)(DNA ladder)。TUNEL测定法是terminal
9、 deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling的缩写,意指末端脱氧核苷酸移换酶末端脱氧核苷酸移换酶介导的dUTP缺口末端标记测定法。这一方法能对DNA分子中3-OH断裂缺口进行原位标记。凋亡细胞的核DNA中产生的3-OH末端,可藉助一种可观测的标记物,如荧光素进行原位标记,并用荧光显微镜进行观察。TUNEL测定法测定法:即即DNA断裂的原位末端标记法断裂的原位末端标记法 细细 胞胞 凋凋 亡亡 的的 基基 因因 调调 控控 机机 制制 最最 先先 是是 从从 线线 虫虫(c.elegansc.elegans)研研究究开
10、开始始的的(MIT:Robert Horrid,1986)。线线虫虫是是一一种种细细胞胞定定数数细细胞胞,在在个个体体发发育育中中,成成体体的的10901090个体细胞中,有个体细胞中,有131131个注定是要自然凋亡。个注定是要自然凋亡。三、细胞凋亡的分子机制三、细胞凋亡的分子机制C elegans:a mm,transparent body only a few cell types,from zygote to mature adult only in 3.5days.1、与、与PCD有关的基因,负责有关的基因,负责PCD控制:控制:ced-3、ced-4和和ced-9。CED-3CED
11、-3是一个蛋白酶,激活的是一个蛋白酶,激活的CED-3 CED-3 可以水解靶蛋白从而使细胞死亡可以水解靶蛋白从而使细胞死亡,是,是细胞杀手细胞杀手;Ced-4对对ced-3引起的引起的体细胞凋亡体细胞凋亡起促进作用。起促进作用。ced-9可抵消可抵消ced-3的作用,防止细胞被杀死,在的作用,防止细胞被杀死,在ced-3和和ced-4的杀死细胞作用中起负调的杀死细胞作用中起负调控。控。2、与、与PCD过程吞噬作用有关:过程吞噬作用有关:ced-1、ced-2、ced-5-8 和和 ced-103、核酸酶基因(、核酸酶基因(nuc-1),控制控制DNA降解,但非降解,但非PCD所必须。所必须。
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