耐高温、耐酸硷乙醛脱氢酶的护肝解酒原理felq.docx
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1、利用耐高高温乙醇醇氧化酶酶清除人人体内的的酒精葛莘随着生活活水平的的提高,人人们消费费酒精类类饮料的的数量也也越来越越大。科科学研究究及统计计分析表表明,酒酒精产品品对人们们的身体体健康、家庭生生活和社社会活动动都有诸诸多负面面影响。在美国,平均每年有九千万人次急诊病患与饮酒有关,每年有一千人死于饮酒过量。据2000年10月14日大连日报报道,中国的酒精依赖患病率在过去十年中增长了近五倍,由0.12增加到0.68,其中因酒精中毒死亡者增长了10倍。流行病学研究也证实,在精神病院中,近年来因酒精中毒或酒精中毒障碍住院的病人明显上升。如吉林省延边地区,该比例从1964-1979年平均0%-4%上升
2、至1979-1985年的8.0%-23.5% (沈渔邨,1987,1996)。酒精对人人体的危危害酒精对人人体有害害,对肝肝脏最为为严重,胃肠道道、胰腺腺、心脏脏、肾脏脏等也会会造成不不同程度度的损害害。因此此,世界界卫生组组织(WWHO)在一份份报告中中提出: “酒精精中毒是是当今世世界世界界内第一一公害,其毒性性可累及及全身主主要脏器器,对肝肝脏的影影响最大大。在西西方国家家, 880%肝肝硬变(livver cirrrhoosiss)的原原因是酒酒精中毒毒。酒精精中毒对对病毒性性肝炎、肝肝癌的发发生、发发展及预预后都有有着重要要影响。”酒精性肝肝病包括括酒精性性脂肪肝肝、酒精精性肝炎炎、
3、酒精精性肝纤纤维化、酒酒精性肝肝硬化,最最终可演演变为肝肝癌。在在欧洲,饮饮酒量越越高的国国家,因因肝硬化化而导致致的死亡亡率越高高。比如如,瑞典典、丹麦、和英国国等国家家的人均均年饮酒酒量在110升以以下,他他们的肝肝硬化死死亡率在在万分之之十以下下;而法法国的人人均年饮饮酒量高高达277升,他他们的肝肝硬化死死亡率是是上述国国家的三三倍。近近年来随随着生活活水平的的提高,酒酒精性肝肝病在我我国也达达到了不不容忽视视的程度度。据统统计,我我国111亿中的的酒民三三亿多人人,共中中酒精性性肝病的的发病率率在200%左右右。由于于肝脏的的代偿能能力极强强,疾病病早期一一般没有有症状或或某些单单一
4、的症症状不足足以引起起注意,因因此,就就诊时往往往到了了比较严严重的程程度,甚甚至到了了肝脏的的失代偿偿期。在在肝硬化化阶段,如如果不积积极治疗疗,继续续酗酒的的话,患患者在22-4年内内的存活活率极低低。酒精的毒毒害主要要来自乙乙醛科学家早早就证明明,乙醛醛的毒性性是乙醇醇的十倍倍,所以以乙醛是是导致酒酒后症状状的主要要化学物物质(BBrieen aand Looomiss, 119833)。乙乙醛对大大脑内胺胺代谢、AATP酶酶,细胞胞线粒体体的呼吸吸功能、脂肪酸酸氧化功功能,以以及心肌肌蛋白质质的合成成都有很很强的抑抑制作用用。乙醛醛化学性性质活泼泼,与儿儿茶酚胺胺结合能能够形成成吗啡类
5、类似物,是是造成酒酒瘾的主主要化学学物质;乙醛使使羟色胺胺代谢发发生故障障,产生生有幻觉觉作用的的四氢-b-咔啉,造造成酒后后的种种种精神障障碍(Cunnninnghaam aand Baiileyy, 220011; EErikkssoon, 20001)。医学界也也早就知知道过分分喝酒可可能导致致与上消消化道有有关的癌癌症。但但是,科科学试验验证明,酒酒精本身身并不致致癌。那那么,饮饮酒与上上消化道道癌的关关系是怎怎么建立立起来的的呢?越来越多多的研究究表明,酒酒精的第第一个代代谢产物物,乙醛醛,可能能是致癌癌的凶手手(Hommannn ett all., 20000)。一一项国际际研究工
6、工作发现现,族群群中基因因的一个个主要区区别可能能导致唾唾液具有有更高的的致癌可可能性 (Vaakevvainnen et al., 220000) 。这篇篇研究报报告说,酒酒精一旦旦进入了了身体,肝肝脏便开开始通过过代谢反反应来清清除毒物物。 研研究显示示,大约约50%的日本本人和华华人的酒酒精代谢谢酶系统统出现故故障,使使其中间间产物乙乙醛快速速、大量积积累。因因此,他他们喝了了酒会更更容易出出现脸红红、晕眩眩、作呕呕等征兆兆。 对对这些人人来说,他他们的唾唾液中的的乙醛含含量要比比含有健健全酶系系统的人人高出两两倍至三三倍。科科学家相相信,乙乙醛随着着唾液经经过喉咙咙组织时时可能导导致癌
7、症症。此外外,科学学家也说说,口腔腔内的细细菌也可可能具有有把酒精精分解成成乙醛的的功能。因因此,不不注意口口腔卫生生的饮酒酒人士患患上癌症症的机率率更高。乙醛除了了使饮酒酒者对酒酒精更加加敏感,并并造成皮皮肤温度度上升,面面赤,心心律和呼呼吸加快快,血压压降低,口口干,喉喉紧,头头痛,恶恶心等症症状之外外,还能能够造成成脑损伤伤,心肌肌病(ccarddiommyoppathhy) ,胰腺腺炎(ppanccreaatittis) 和胎胎儿酒精精综合症症(feetall allcohhol synndroome) (EErikkssoon, 20001) 。乙醛醛还能够够导致红红血球异异常(LL
8、atvvalaa ett all., 20001) 。乙醛醛通过血血液进入入大脑,能能够组织织神经信信号的传传递,导导致记忆忆丧失,行行为运动动失控(Larrsonn, 119922) 。对酒精的的耐受性性受基因因控制酒精在体体内的代代谢过程程主要由由肝中的的乙醇脱脱氢酶(alccohool ddehyydroogennasee,ADHH)和醛类脱氢酶酶(alldehhydee deehyddroggenaase,ALDDH)所制约约,它们们分别催催化的化化学反应应如下:C2H55OH(酒精) + NADD+ CH3CHOO(乙醛醛) + NADDH+HH+CH3CCHO(乙醛)+ NNAD+
9、 + H2O CH3COOOH(乙乙酸)+ NNADHH+H+第一个反反应生成成的乙醛醛可刺激激肾上腺腺素、去去甲肾上上腺素等等物质的的分泌,引引起面红红耳赤、心心率快、皮皮温高等等症状。除了AADH/ALDDH系统统之外,微微粒体乙乙醇氧化化系统(miccrossomaal eethaanoll oxxidiizinng ssysttem) 也能够够将乙醇醇氧化成成乙醛,但但在这个个酒精代代谢中的的作用仅仅占五分分之一左左右。人类的乙乙醇脱氢氢酶(AADH)系统非非常复杂杂,至少少可以分分成六类类同工酶酶。I-V类ADHH基因编编码a, b, g, p, c 型肽链,通通过不同同组合,它它们
10、可以以形成至至少八个个同型或或异型双双体。II类ADHH包括同同工酶a, b, g 亚基,分分别由AADH11,ADHH2,ADHH3基因位位点编码码,III 类AADH包包括p 亚基,由由ADHH4基因位位点编码码。这两两类ADDH都是是肝脏酶酶。IIII类ADHH包括c 型肽链,由由ADHH5基因位位点编码码,是一一个甲醛醛脱氢酶酶。IVV类ADHH包括s 型肽链(PIID:gg613374442),由由ADHH7基因位位点编码码,主要要在胃和和食道器器官表达达。V类ADHH由ADHH6基因位位点编码码,但在在人体内内尚未检检查到它它的活性性。对VVI类ADHH的研究究不多。在人类中中,I
11、类ADHH在乙醇醇代谢中中起主要要作用。成人主要是链二聚体,来自ADH2基因。ADH2具有多态性,大多数白种人为ADH2-1,由11组成;而90黄种人为ADH2-2由1的变异肽链2(47位精氨酸组氨酸)组成(22)(Jornvall et al., 1984; Matsuo et al., 1989)。22的酶活性约为11的100倍,故大多数白种人在饮洒后产生乙醛较慢,而黄种人积蓄乙醛速度较快(Thomasson et al., 1995; Yin et al., 1992) 。人体内有有十多种种醛类脱脱氢酶(ALDDH)(Vassiliiou et al., 220000; YYoshhid
12、aa ett all., 19998)。根据对对乙醛的的Km值高高低,可可以把人人类ALLDH同同工酶分分成两大大类:对对乙醛的的Km值高的的(超过毫毫摩尔浓浓度,也也就是只只有在乙乙醛浓度度高时才才有催化化作用) 和对对乙醛的的Km值低的的(微摩尔尔浓度,在在乙醛浓浓度低时时即有催催化作用用) 。前前者包括括ALDDH3 (Kmm =883 mmM) 和ALLDH44 (KKm =55 mMM) ;后者包包括ALLDH11 (KKm =330 mMM) 和和ALDDH2 (Kmm =33 mM) (YYin et al., 119933) 。所所以,人人体内的的乙醛氧氧化主要要由ALLDH1
13、1和ALDDH2来来完成,而ALDH2对乙醛的活性较ALDH1活性高出约10-50倍(Vasiliou et al., 2000; Yoshida, 1998)。ALDH1存在于细胞浆内,ALDH2存在于线粒体内。ALDH2由54 kDa的亚基形成四聚体。多数东方方人种的的ALDDH2基基因为突突变型(ALDDH2*2,即ALLDH22的第4887个氨氨基酸由由谷氨酸酸(E)变成了了赖氨酸酸(K)。这导导致ALLDH22*2丧失了了脱氢酶酶的活性性(Yooshiida et al., 119844; YYoshhidaa annd DDavee, 119855; FFarrres et al.
14、, 119944)。黄种人中中有3种种乙醛脱脱氢酶表表现型:1, 普通型,AALDHH1 + ALLDH22*1,约占占人口总总数的550%;2, “非经典典型attypiicall”,有有ALDDH1 + AALDHH2*2 ,约约占人口口总数的的50%;3, 罕见的“非非经典型型”,仅仅有ALLDH22无ALLDH11,只在在个别日日本人中中发现。几乎所有有的白种种人都为为普通型型(Shiibuyya aand Yosshidda, 19888; Thoomasssonn ett all., 19994; Yinn ett all., 19992)。因此,可可以说黄黄种人较较白种人人易产生
15、生酒精中中毒的原原因是遗遗传因素素决定的的。由于于黄种人人的ADDH活性性高,饮饮酒后乙乙醇很快快被氧化化成乙醛醛,而由由于ALLDH的的活性低低,使乙乙醛迟迟迟不能够够被氧化化成乙酸酸,所以以产生酒酒后的诸诸多中毒毒症状(Yinn ett all., 19992)。酒精中毒毒的基因因补救人体排除除酒精的的通道有有肺脏(呼吸)、肾脏脏(排尿) 和肝肝脏(代谢),其中中90-98%是通过过肝脏内内的代谢谢来完成成的。酒酒精在被被饮用之之后,要要经过口口腔、食食道、胃胃和小肠肠,然后后进入血血液,其其中700-800%以上上在肠腔腔内进入入血液,20-30%左右从胃脏进入血液,通过口腔和食道进入血
16、液的仅占极少部分。血液中的乙醇被运输到肝脏,转化成乙酸,后者最终被分解成二氧化碳和水。酒精在血液中消失的速度为每小时100-200毫克/公斤体重 ,一个75公斤体重的健康成人每小时能够代谢7.5-15克乙醇。除了在肝肝脏代谢谢之外,乙乙醇在从从进入口口腔到被被血液吸吸收这个个过程中中被氧化化叫做“第一通通道代谢谢(ffirsst-ppasss mmetaabollismm”) ,主要要通过口口腔、食道、胃肠内内的乙醇醇氧化酶酶系统将将乙醇氧氧化。人人类的第第四类乙乙醇脱氢氢酶s-AADH就就主要存存在于上上食道的的黏膜,而而不存在在于肝内内(Faarrees eet aal., 19994)
17、。s-AADH是是所有AADH中中活性最最高的(Morrenoo annd PParees, 19991; Morrenoo ett all., 19994; Farrress ett all., 19994) ,但由由于总量量少(大约100微克/克组织织) ,加加上乙醇醇迅速进进入血液液,所以以胃内乙乙醇氧化化在酒精精代谢中中所起的的作用不不是很大大(Paaress, 119933)。很显然,消消除酒精精毒害的的最好办办法就是是在其进进入血液液之前,将将它氧化化成没有有毒性的的乙酸。不不过,消消化系统统的环境境十分不不利于乙乙醇代谢谢酶。首首先,胃胃液的酸酸硷度(pH值值) 在1-3左右右,
18、平均均值大约约是2,肠腔腔(inntesstinnal lummen)的pH值可可能高达达8-99左右。因因此,细细胞内的的ADHH和ALDDH在胃胃中几乎乎不起作作用。肠肠胃液体体中,除除有少量量的ADDH外,很很少有AALDHH的存在在。其次次,胃液液中的离离子 (特别是是胆汁盐盐) 对乙乙醇氧化化酶(ADHH和ALDDH)也有抑抑制作用用。再其其次,胃胃肠液中中NADD+的含含量很少少,乙醇醇的氧化化缺乏电电子受体体,无法法进行。最最后,胃胃液中的的蛋白酶酶更是其其他酶的的天敌,在在它们能能够发挥挥作用之之前就已已经被分分解成氨氨基酸了了。所以,要要通过口口服外源源乙醇氧氧化酶来来治疗乙
19、乙醇代谢谢基因的的缺陷,首首先要克克服上面面的问题题。另外外还要考考虑的问问题就是是外源蛋蛋白在生生产加工工过程中中的稳定定性。比比如人类类ALDDH2*1在细胞胞外的稳稳定很差差,经过过加工之之后,绝绝大部份份生物活活性已经经丧失殆殆尽。乙醇氧化化酶系统统存在于于几乎所所有的生生物中。从从耐酸、耐耐硷、耐耐高温的的生物中中把相应应的基因因克隆出出来,让让它们在在生物反反应器中中超量表表达,经经过简单单纯化,就就能够得得到大量量、纯净净的酶制制品。由由于它们们来自的的生物在在高温和和酸硷环环境中生生长,所所以这些些酶一般般也能够够在相同同的环境境中起作作用。根根据它们们的特性性,可以以把它们们
20、制成酸酸性和硷硷性饮料料或汤料料,在饮饮酒时同同时饮用用,就能能够将酒酒精代谢谢产生的的乙醛氧氧化成乙乙酸,防防止其对对人体的的毒害。硫叶菌(Sullfollobuus ssolffataariccus) 是一种种从硫矿矿中分离离出来的的古细菌菌,最适适生长温温度是880oC,最适适pH值在在2-44之间(CCharrlebboiss ett all., 19998; Shee ett all., 20001)。硫硫叶菌的的基因组组已经全全部解码码(Shhe eet aal., 20001),其中中有133个基因因编码乙乙醇脱氢氢酶,11个基因因编码醛醛类脱氢氢酶。对对这些基基因进行行序列分分
21、析,发发现其中中的ADDH3编编码的蛋蛋白质具具有典型型的乙醇醇脱氢酶酶结构域域,并与与人类的的第四类类乙醇脱脱氢酶s-ADHH有45%的相似似性;AAldhhT基因因编码的的醛类脱脱氢酶与与人类的的ALDDH2有有54%的相似似性(见下) 。同样,在在嗜硷耐耐高温枯枯草杆菌菌Baccilllus halloduuranns的基基因组中中,有四四个乙醇醇脱氢酶酶基因,11个醛类脱氢酶基因,后者中的两个, dhaS和aldA与人类的ALDH2有很高的相似性。项目内容容利用基基因工程程手段克克隆人类类及嗜酸酸嗜硷耐耐高温细细菌的乙乙醇、乙醛脱脱氢酶基基因,使使其在大大肠杆菌菌和酵母母细胞中中超量表
22、表达,经经过纯化化之后,与与辅剂、添加剂剂制成片片、丸、散、胶囊、汤料等等制剂,供供消费者者在饮酒酒的同时时服用,加加速消除除体内乙乙醇、乙醛,达达到保肝肝健体的的作用。细菌乙醇、乙醛脱氢酶在大肠杆菌中的超量表达将嗜酸硫叶菌和嗜硷枯草杆菌的乙醇、乙醛脱氢酶基因克隆到表达载体中,然后转化大肠杆菌工程菌株。在没有诱导目的基因表达的生长环境下(泳道1-3),目的基因没有表达。当加入诱导剂之后(泳道4-6),目的基因超量表达,目的蛋白质(箭头所指)可达细菌蛋白质总量的50%以上。泳道1,4:硫叶菌乙醛脱氢酶基因克隆泳道2,5:枯草杆菌乙醛脱氢酶基因克隆泳道3,6:硫叶菌乙醇脱氢酶基因克隆泳道M:蛋白质
23、分子量标记 1 2 3 4 5 6 M 技术路线线乙醇、乙醛脱氢酶基因的克隆与辅酶、缓冲剂、添加剂混合干燥在大肠杆菌中表达纯化重组乙醛脱氢酶包装,储存,运输,销售干燥在啤酒酵母中表达发酵破碎细胞酶活性检验安全性考考虑:从理论上上分析,蛋蛋白质在在肠胃消消化系统统中很快快就会被被蛋白酶酶分解成成氨基酸酸,所以以,除了了少数毒毒素蛋白白质外,绝绝大多数数蛋白质质作为食食品服用用是安全全的。而而微生物物蛋白供供人使用用的例子子更是多多得举不不胜举。比比如,金金黄葡萄萄球菌产产生的葡葡激酶可可以用来来治疗心心肌梗塞塞,病毒毒蛋白质质制成的的疫苗可可以直接接注射到到人的体体内。人人类食用用苏芸金金杆菌的
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