PCR技术82001.ppt
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1、专题专题5 DNA5 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术课题课题2 2多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片断片断分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一其本质是在体外模拟胞内其本质是在体外模拟胞内其本质是在体外模拟胞内其本质是在体外模拟胞内DNADNADNADNA分子复制的过程分子复制的过程分子复制的过程分子复制的过程美美美美国国国国科科科科学学学学家家家家穆穆穆穆利利利利斯斯斯斯(K K K K.B B B B.M M M Mu u u ul l l ll l l li i i
2、is s s s)发发发发明明明明了了了了P P P PC C C CR R R R技技技技术术术术1 1 1 19 9 9 99 9 9 93 3 3 3年年年年诺诺诺诺贝贝贝贝尔尔尔尔奖奖奖奖 学习目标1、体验PCR这一分子生物学实验方法2、理解PCR原理3、了解PCR应用多聚酶链式反应多聚酶链式反应(PCR技术技术),是一种在体外快速扩增特定基因或是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,故又称为序列的方法,故又称为DNA体外扩体外扩增技术增技术。一、基础知识一、基础知识PCR技术扩增时,DNA的复制过程和细胞中的类似脱氧脱氧核苷核苷酸酸脱氧核苷脱氧核苷磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖含氮
3、含氮碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤(腺嘌呤(A A)鸟嘌呤(鸟嘌呤(G G)胞嘧啶(胞嘧啶(C C)胸腺嘧啶(胸腺嘧啶(T T).DNA.DNA分子的结构分子的结构1.1.元素组成:元素组成:C C、H H、O O、N N、P P2.2.基本单位基本单位:脱氧核苷酸脱氧核苷酸一个核苷酸上的一个核苷酸上的一个核苷酸上的一个核苷酸上的磷酸基团上的磷酸基团上的磷酸基团上的磷酸基团上的“OHOHOHOH”和和和和另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第3 3 3 3位碳原子位碳原子位碳原子位碳原子上的羟基上的羟基上的羟基上的羟基之间失去一分子水,形成之间失去一分
4、子水,形成之间失去一分子水,形成之间失去一分子水,形成磷酸二酯键,磷酸二酯键,磷酸二酯键,磷酸二酯键,即在即在即在即在相邻的相邻的相邻的相邻的两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸的的的的3 3 3 3和和和和5 5 5 5碳原子碳原子碳原子碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3 3 3 3、5 5 5 5、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。、磷酸二酯键彼此连接起来形成
5、脱氧核苷酸链。、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将通常将通常将通常将DNADNADNADNA的的的的羟基羟基羟基羟基“OHOHOHOH”末端称为末端称为末端称为末端称为3 3 3 3端,而磷酸基团的末端称为端,而磷酸基团的末端称为端,而磷酸基团的末端称为端,而磷酸基团的末端称为5 5 5 5端端端端3.3.脱氧核苷酸链的形成脱氧核苷酸链的形成多脱氧核苷酸链结构简图多脱氧核苷酸链结构简图4 4、DNADNA分子的平面结构分子的平面结构ATGCAGCT氢氢氢氢键键键键5端端3端端5端端3端端 识别识别:DNA分子的分子的3 端与端与5 端端-OH端为端为3 ;磷酸基团的末磷酸基团的末端
6、为端为5。5.5.DNADNA分子的双螺旋结构分子的双螺旋结构.DNA.DNA分子是由分子是由 的(即一条的(即一条链为链为3 35 5,另一条链为,另一条链为5 53 3)脱氧)脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。结构。.与与 交替连结,排列在外侧,交替连结,排列在外侧,构成基本骨架;构成基本骨架;排列在链的内侧。排列在链的内侧。.两条链上的碱基通过两条链上的碱基通过 连结起来,形连结起来,形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律:即成碱基对。碱基对的组成有特定的规律:即腺嘌呤一定与腺嘌呤一定与 配对,配对,一定一定同胞嘧啶配对。同胞嘧啶配对。双螺旋双螺旋两条反向平行两条
7、反向平行脱氧核糖脱氧核糖磷酸磷酸碱基碱基氢键氢键胸腺嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤鸟嘌呤参与的组分参与的组分参与的组分参与的组分在在在在DNADNADNADNA复制中的作用复制中的作用复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶DNADNADNADNA母链母链母链母链4 4 4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶引物引物引物引物打开打开打开打开DNADNADNADNA双链双链双链双链提供提供提供提供DNADNADNADNA复制的模板复制的模板复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原料合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成催化合
8、成催化合成DNADNADNADNA子链子链子链子链使使使使DNADNADNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3 3 3 3端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸.DNA.DNA的复制的复制 思考:思考:体内体内DNADNA复制的条件复制的条件是什么是什么?体外扩增体外扩增DNA DNA 如何提供相似环境如何提供相似环境?.PCR(PCR(多聚酶链式反应)多聚酶链式反应)2.DNA2.DNA聚合酶聚合酶特性特性不能从头合成不能从头合成DNADNA,只能从只能从DNADNA的的33端开始延端开始延伸伸DNADN
9、A链,因此,链,因此,DNADNA复制需要引物。复制需要引物。3.DNA3.DNA聚合酶作用过程聚合酶作用过程当引物与当引物与DNADNA母链通过碱基互补配对结合后,母链通过碱基互补配对结合后,DNADNA聚合酶就能从引物的聚合酶就能从引物的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链,链,DNADNA的的合成方向合成方向总是从子链的总是从子链的55端向端向33端端延延伸伸。1.1.定义:定义:是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增DNADNA片段的技术。能以极片段的技术。能以极少量的少量的DNADNA为模板,在几小时内复制出上百万为模板,在几小时内复制出上百万份的份的DNADNA拷贝。拷贝。靶序列靶
10、序列靶序列靶序列靶靶靶靶序列序列序列序列引物引物引物引物 引物引物引物引物 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4、PCRPCR原理原理.在在8080100100C C的温度范围内,的温度范围内,DNADNA的的双螺旋双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性。结构将解体,双链分开,这个过程称为变性。.当温度缓慢降低后,当温度缓慢降低后,两条彼此分离的两条彼此分离的DNADNA链链又会重新结合成双链。又会重新结合成双链。.PCR.PCR利用了利用了DNADNA的的热变性原理,通过控制温度热变性原理
11、,通过控制温度来控制双链的解聚与结合,来控制双链的解聚与结合,从而完成体外从而完成体外DAN分子的扩增。分子的扩增。现在使用的现在使用的PCRPCR仪仪实质上也是一台能够自动调控实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。温度的仪器。高温解决了打开双链的问题,但是,又导致高温解决了打开双链的问题,但是,又导致高温解决了打开双链的问题,但是,又导致高温解决了打开双链的问题,但是,又导致DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶失活的问题,耐高温的失活的问题,耐高温的失活的问题,耐高温的失活的问题,耐高温的TaqTaqTaqTaq DNA DNA DNA DNA聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温
12、导致聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温导致DNADNADNADNA聚合酶失活的问题,促成了聚合酶失活的问题,促成了聚合酶失活的问题,促成了聚合酶失活的问题,促成了PCRPCRPCRPCR技术的自动化。技术的自动化。技术的自动化。技术的自动化。(4.(4.)TaqTaq DNA DNA聚合酶的应用聚合酶的应用PCRPCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出。简便、重复性好、易自动化等突出。(5 5).PCR.PCR技术的特点:技术的特点:.PCR
13、.PCR过程需要的引物不是过程需要的引物不是RNARNA,而是人工合而是人工合成的成的DNADNA单链,其长度通常为单链,其长度通常为20203030个脱氧核个脱氧核苷酸苷酸(6).6).细胞内复制和细胞内复制和PCRPCR不同点不同点.PCR.PCR过程中过程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶,而是通的解旋不依靠解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的过对反应温度的控制来实现的(7).PCR(7).PCR的重要应用:的重要应用:广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和学、基因克隆和DNADNA序列测定等。序列测定等。二、二、PCRPCR的反
14、应过程的反应过程1 1、PCRPCR的反应步骤的反应步骤PCRPCR一般经历三十多次循环,一般经历三十多次循环,每次循环可以每次循环可以分为三个基本步骤分为三个基本步骤变性、复性和延伸变性、复性和延伸变性(模板变性(模板DNADNA解旋)解旋)模板模板DNADNA经加热至经加热至90900 0C C以上。一定时间后,使以上。一定时间后,使模板模板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNADNA解解离,使成为单链,以便于它与引物结合,为下离,使成为单链,以便于它与引物结合,为下轮反应作准备轮反应作准备2 2、循环过程循环过程靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序
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