免疫调节治疗鼠获得性免疫缺陷综合征的重要性,免疫学论文.docx
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1、免疫调节治疗鼠获得性免疫缺陷综合征的重要性,免疫学论文 艾滋病毒 ( HIV) 属于人类逆转录病毒属,导致的疾病称为获得性免疫缺陷综合征( Acquired im-munodeficiency syndrome,AIDS) ,是人类研究最多的疾病之一1-7,可是自发现以来不断在全球蔓延,病死率极高1.至今为止,仍没有药物能够根治艾滋病,也无可靠疫苗.众所周知,任何感染性疾病的发生,都以机体的免疫能力无法战胜病原微生物为致病机制.研究发现机体去除细胞内感染病原微生物( 比方病毒感染) 以细胞免疫为主,体液免疫作用甚小4,5,研究表示清楚机体免疫系统与被 HIV 感染的细胞 ( HIV 最主要的靶
2、细胞是 CD4+T 淋巴辅助细胞: CD4+Th 细胞) 之间的互相作用是影响艾滋病患者预后及存活期长短的关键,但究竟 HIV 是怎样通过其宿主靶细胞,利用哪些免疫抑制机制,怎样经历机体免疫抑制机制和免疫保卫机制之间的平衡,进而抑制和攻击机体的免疫系统 ( 在抗病毒感染中最关键的是 CD8+T 细胞) ,最终摧毁免疫功能等等,尚知之甚少.由于病毒是严格的细胞内寄生生物,现有的治疗手段往往在杀灭病毒的同时对宿主产生难以修复的严重损害.当前抗艾滋病毒药物也面临着多重耐药和毒副作用的挑战,治疗的局限性进一步表示清楚机体免疫功能重建的重要性.寻找新型、可靠和有效的免疫治疗方案,在感染早期就开场使用,并
3、通过提高机体的 CD8+T 细胞免疫杀伤能力,进而控制病毒感染的发生与发展,就显得特别重要. 1 、鼠逆转录病毒导致获得性免疫缺陷综合征模型概述 由于 HIV-1 的宿主范围窄,只能感染人、猩猩和长臂猿,但这些非人的灵长类动物价格昂贵,较难获得,缺乏可靠的动物模型是限制艾滋病治疗研究的主要障碍之一.故此,多年来 MuLV/Murine AIDS系统已被广泛用作非人的灵长类动物以外最有效的实验 模 型,以 研 究 和 探 索 逆 转 录 病 毒 导 致 的AIDS8-22.这些鼠 AIDS 模型也被作为评价研究AIDS 的重要模型8-25,并用于研发中药及其他新型AIDS 治疗方案的重要初筛模型
4、9,23-27.鼠白血病病毒( Murine leukemia virus,MuLV)导致敏感鼠( 新生鼠) 脾和淋逢迎增大,免疫抑制和时机性感染等异常感觉和状态,被称为鼠艾滋病 ( MAIDS)9. LP-BM5 属于鼠逆转录病毒属8,是从放射性白血病小鼠的骨髓中分离到的鼠白血病病毒.在敏感小鼠中导致的疾病异常感觉和状态与 AIDS 极为类似,被国内外学者称为鼠获得性免疫缺陷综合征 ( Murine ac-quired immunodeficiency syndrome,MAIDS)8-22.固然 LP-BM5 和 HIV 有显著不同,分属于人类逆转录病毒和鼠逆转录病毒,但 LP-BM5 导
5、致的 MAIDS 与AIDS 有众多类似之处,主要包括: CD4+Th 细胞均为两病始发的关键,随着 CD4+Th 细胞的功能逐步丧失,逐步导致严重的 T 与 B 细胞免疫缺陷,最后合并晚期多种感染与肿瘤的发生,包括晚期淋巴瘤. LP-BM5 能够使敏感鼠产生多克隆 B 细胞增殖、高球蛋白血症和 T 细胞功能丧失,约在感染后26 周死于 B 细胞淋巴瘤或时机性感染9.病毒接种前或病毒接种的同时,给予 AZT 治疗能够完全保卫病毒接种鼠不受 LP-BM5 感染,但对接种病毒 1 周后的鼠,AZT 只具有部分保卫作用6,这表示清楚早期治疗是关键.本文将重点阐述免疫调节治疗鼠逆转录病毒导致鼠获得性免
6、疫缺陷综合征的重要性.我们长期以1( MAIDS) 模型,该模型是研究 HIV/AIDS 的极好的小动物模型,既方便又经济,且易于操作.MAIDS模型已被世界公以为最理想的小动物模型并广泛用于开发抗逆转录病毒的药物及发病机制的研究,很多在灵长类动物或者人类身上无法做到的实验,都能够用 MAIDS 来研究,它可作为当今最流行的各种转基因和基因缺陷型小鼠的有力动物模型. 我们的主要研究侧重在研究鼠 LP-BM5 逆转录病毒的发病机制及致病性 CD4+Th 细胞与宿主保卫性的 CD8+T 细胞之间的互相作用28-31.格林实验室开展 MAIDS 模型致病机理和机体保卫性免疫功能的研究已长达 25 年
7、之久28-38.我们的早期研究发现: LP-BM5 逆转录病毒感染主要组织相容性H-2D鼠株 ( 如 BALB/c 小鼠) 时,宿主能够产生强烈的抗 LP-BM5 逆转录病毒特异性的 CD8+T 细胞反响32,38.删除 CD8+T 细胞将使抗性 BALB / c 小鼠转变为 MAIDS 敏感型,表示清楚 CD8+T 细胞 是抗MAIDS 的关键32,38.相反,LP-BM5 逆转录病毒感染主要组织相容性 H-2B鼠株 ( 如 C57BL/6 鼠: B6小鼠) 时,与 HIV/AIDS 极为类似,宿主只产生不够强烈的抗病毒特异性的 CD8+T 细胞反响结果,缺乏以去除病毒,进而导致 MAIDS
8、 的发生、发展、晚期严重的多重感染28-30,33,34,37.删除 CD4+T 细胞将使敏感性 B6 小鼠转变为 MAIDS 抗性,表示清楚 CD4+T细胞是 MAIDS 致病所需11,12,28-30,33,34,37.最重要的是,我们的最新研究结果( 未发表) 表示清楚在 LP-BM5逆转录病毒感染敏感型的小鼠 ( 如 B6 小鼠) ,至少在病毒感染的早期,能够检测到较强的针对 LP-BM5 逆转录病毒及 MAIDS 相关性 B 细胞淋巴瘤杂交瘤细胞株特异性的 CD8+T 细胞反响,比方: 特异性 CD8+T 细胞活化与增生,产生抗病毒和抗肿瘤特异性的细胞因子( 如 IFN- ) ,以及
9、抗原特异性的细胞毒 性 T 细 胞 作 用 ( Cytotoxic T lymphocytes,CD8+CTLs) ,CD8+T 细胞能特异性辨别与杀伤被LB-BM5 病毒感染的细胞及淋巴瘤 B6-1710 细胞株35,36,此项最新结果表示清楚,在 LP-BM5 逆转录病毒感染的敏感型小鼠中,至少在感染的早期能够检测到抗病毒特异性的 CD8+T 细胞反响,但正如 HIV感染病人中,感染的早期能够检测到的 CD8+T 细胞功能皆无法战胜病毒,导致大量的 HIV 病毒复制及 AIDS 的严重发展,最终均以患者 ( 宿主) 死亡而告终.假如这些早期能够检测到的抗病毒特异性CD8+T 细胞功能能够得
10、到及时的稳固和加强,就有可能在感染的早期去除病毒,或至少加强对病毒感染的控制,进而改变或延缓逆转录病毒所致 AIDS的发生与发展.故此,通过免疫调节治疗,加强和提高这些早期能够检测到的抗病毒特异性 CD8+T细胞功能,完全有可能控制 MAIDS 的发生和发展. 2 、CD4+Treg 细胞在鼠逆转录病毒导致获得性免疫缺陷综合征模型中的作用 近年来的研究发现,多种的机体免疫调节和免疫抑制机制往往是最终导致病毒性感染发生和发展的主要原因,免疫调节细胞 ( 又名免疫抑制细胞,CD4+T regulatory cells,Treg 细胞) 是在这些多种免疫抑制机制中研究报道最多的一种.Treg 细胞在
11、病毒性感染疾病中大量扩增,这些 Treg 细胞起着抑制机体免疫功能的作用,主要是针对 CD8+T 细胞,进而抑制了机体 ( CD8+T 细胞) 杀伤细胞内寄生的病原微生物( 抗病毒) 的能力,导致病毒性感染的发生及严重发展.因而,CD4+Treg 细胞能够抑制抗病毒特异性的 CD8+T 细胞 功能,选择性抑制Treg 细胞,能够加强机体的抗病能力,进而防止病毒性感染的发生与发展. 在正常的小鼠 CD4+T 细胞当中,约有 5% 10% 的 CD4+T 细胞表示出 IL-2R 链 ( CD25+) ,这些正常小鼠中的 CD25+CD4+细胞亚群被命名为天然免疫调节细胞 ( Natural T r
12、egulatory cells,nTreg 细胞)39,40.除了 CD25+以外,GITR 和细胞毒 T 细胞抗原4( CD152,cytotoxic T-lymphocytes antigen-4,CT-LA-4) 等白细胞外表分化抗原曾用作辨别 Treg 细胞的标记,但由于这些标记在活化的 CD4+T 细胞外表也有表示出39,40,故 CD25、GITR 或 CTLA-4 均已被淘汰掉,不再是能够特异性辨别 Treg 细胞的标志.进一步的研究表示清楚,转录因子中的 FoxP3( Amember of the forkhead winged helix protein family oft
13、ranscription) 在小鼠和人体中均被公以为是辨别Treg 细胞最特异性的标记41,42.最近,FoxP3-GFP小鼠的成功研制,迅速使关于 Treg 细胞的研究进入一个飞跃发展的现代.该 FoxP3-GFP 小鼠可将FoxP3 基因与一个绿色荧光蛋白 ( Green fluorescentprotein,GPF) 融合,并通过流式细胞仪辨别绿色荧光 GFP 来辨别 FoxP3+的 Treg 细胞. FoxP3+Treg 细胞在几种动物逆转录病毒中起着关键的抑制抗病毒特异性 CD8+T 细胞功能的作用43-51,如小鼠的 Friend 逆转录病毒( Murine friendretro
14、virus,FV) 和 Feline 免疫缺陷病毒( Feline immu-nodeficiency virus,FIV)43-46.Treg 细胞在人类慢病毒感染中也起着抑制抗病毒特异性 CD8+T 细胞功能的作用,如丙型肝炎病毒( Hepatitis C virus,HCV)及巨细胞病毒( Cytomegalovirus,CMV)47,48.至于Treg 细胞抑制抗 HIV 病毒特异性 CD8+T 细胞的功能,有限的文献报道只局限于一些体外实验 ( invitro) ,研究结果表示清楚 CD4+Treg 细胞能够在体外抑制抗 HIV 病毒特异性的 CD8+T 细胞功能49,50.删选掉
15、Treg 细胞能够加强抗病毒特异性 CD8+T 细胞的功能,包括记忆性 CD8+T 细胞的功能48. 3 、CD8+T 细胞是抗 MAIDS 的关键 国外同行及我们的前期研究发现,BALB/c 小鼠感染 LP-BM5 逆转录病毒后,该鼠非但不导致MAIDS,而且能产生保卫性的抗 LP-BM5 病毒特异性的 CD8+T 细胞反响,包括 CD8+T 细胞活化与增生,产生抗病毒特异性的细胞因子( 如 IFN- ) 和细胞毒型 CD8+T 细胞作用( CTLs) 能特异性辨别与杀伤被 LB-BM5 病毒感染的细胞,进而去除病毒而不导致任何疾病的发生,且能抵抗病毒的再次感染. 但是,假如给 BALB/c
16、 小鼠注射抗 CD8+T 细胞的抗体,或者感染先天性 CD8+T 细胞缺陷的小鼠( BALB/c. CD8- / -小鼠) ,这些先天抗性的小鼠在缺乏 CD8+T 细胞时转变为敏感型而导致 LP-BM5 病毒引起的 MAIDS32.假如采用 LP-BM5 病毒感染的 BALB/c 小鼠为供体,用磁珠分离出抗 LP-BM5病毒特异性的 CD8+T 细胞,而不是 CD4+T 细胞,经静脉输注到敏感型的 BALB/c. CD8- / -受体中,这些受体又能抵抗 LP-BM5 病毒的感染32.这些研究结果强有力地证明: CD8+T 细胞是抗 LP-BM5 病毒感染的关键. 4 、CD4+T 细胞是 M
17、AIDS 致病所需 我们首先采用 LP-BM5 病毒感染 B6 小鼠,该先天敏感型小鼠将导致 MAIDS.在所有的实验中,我们采用国际通用的标准来衡量 MAIDS 的严重程度,详细包括脾脏重量及血清中无功能的免疫球蛋白( IgM 和 IgG2a) 的水平,其增加的程度代表由 LP-BM5 引起的多克隆 T 和 B 淋巴细胞活化与增生的程度;3H 穿入法定量检测 T 细胞对 ConA 和 B 细胞对 LPS 天然抗原分化原的刺激反响,其降低的程度代表由 LP-BM5 病毒引起的 T 和 B 细胞免疫缺陷的程度; 采用 RT-PCR 检测 LP-BM5 病毒载量( Viralload) 在血液和各
18、淋巴组织器官中持续上升.根据我们的常规方式方法采用 LP-BM5 感染敏感性 B6 小鼠,以上各项指标均得到同样结论: 脾脏重量及血清中免疫球蛋白( IgM 和 IgG2a) 的水平持续上升,同时 T细胞对 ConA 和 B 细胞对 LPS 天然抗原分化原的刺激反响持续下降,病毒载量持续上升,具体的实验结果参见我们最近发表的论文30.值得关注的是,在LP-BM5 感染的第 14 天,与未感染阴性对照组比拟,实验组的脾脏重量已经显著超过了阴性对照组( P 0. 05) .更令人惊讶的是,与此吻合,在 LP-BM5 病毒感染敏感型 B6. FoxP3-GFP 小鼠中我们检测到早期病毒感染引起的 F
19、oxP3+CD4+Treg 细胞大量扩增,时间也是在 LP-BM5 病毒感染后的第 14 18 天的时间,FoxP3+CD4+Treg 细胞在 CD4+T 细胞的百分比及鼠脾脏中 FoxP3+CD4+Treg 细胞的总数均到达高峰,该时间段与 MAIDS 疾病呈现显著差异的时间点相近,不得不令人揣测,在 MAIDS 疾病早期,即使不是唯一的抑制机制,至少相当一部分可能由于此阶段的 CD4+FoxP3+Treg 细胞大量增加和急速扩增,将严重抑制着机体免疫功能和抗病毒的能力 ( 抗病毒免疫中最主要的是 CD8+T 细胞的功能) ,进而导致 MAIDS 疾病的发生、发展及严重预后.该敏感鼠多在感染
20、后的 3 4 个月合并多重感染和/或肿瘤 ( 如非柯杰金氏 B 细胞淋巴瘤) 而死亡.但是,拯救这些先天敏感型小鼠命运的方式方法是,给这些先天 MAIDS 敏感性的 B6 小鼠注射抗 CD4+T 细胞的单克隆抗体,或感染先天性 CD4+T 细胞缺陷小鼠,比方 B6. nude 裸鼠或 B6. TCRa- / -小鼠将转变为 MAIDS 抗性.最为关键的是,国外同行以及我们的前期研究结果均表示清楚: 采用磁珠分离法从野生型 B6 小鼠供体中分离出 CD4+T 细胞,而不是CD8+T 细胞,经鼠尾静脉输注到这些先天性 CD4+T 细胞缺陷的 B6. nude 裸鼠或 B6. TCRa- / -受体
21、小鼠中,这些先天 MAIDS 抗性的受体在得到致病性的CD4+T 细胞 ( 而不是保卫性的 CD8+T 细胞) 后又能够导致 MAIDS 发生、发展及其晚期肿瘤等28-30. 这些 研 究 结 果 强 有 力 地 证 明: CD4+T 细 胞 是MAIDS 致病所需. 5 、程序凋亡因子-1 ( Programmed Death-1:PD-1) 在鼠逆转录病毒导致获得性免疫缺陷综合征模型中的作用 如前所述,很多动物和人类慢病毒感染 ( 包括HIV / AIDS) 的发生和发展皆由于 CD8+T 细胞无能所致.CD8+T 细胞功能的缺陷和无能往往是病毒感染发生与严重发展的直接原因52,53.最近
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