B16黑素瘤细胞传代培养方法.pdf
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1、B B1 16 6 黑黑素素瘤瘤细细胞胞传传代代培培养养方方法法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1细胞传代培养细胞传代培养一仪器的清洗与消毒(一)实验材料仪器:倒置显微镜、96 孔板、微量移液器(枪及枪头)、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、烘箱、牛皮纸、棉线、培养平皿、喷壶、脱脂棉、封口膜、培养瓶 100ml、点滴瓶(250ml、500ml)、烧杯(500ml、50ml)、量筒(500ml,100ml,10ml),滤器及滤膜()酒精灯、移液管、吸球、吸管架及瓶架、镊子、标签贴、液氮罐或冰箱冰柜、双蒸器、超净台、细胞冻存管试剂:胎牛血清、DMEM 培养基、胰蛋白酶、
2、PBS 液、75%酒精(二)清洗消毒方法 1.玻璃仪器(1)新玻璃仪器1%稀盐酸浸泡过夜自来水冲洗(5-6 次)洗涤剂清洗自来水冲洗(5-6 次)甩干浸酸(瓶内不能有气泡)过夜自来水冲洗(20次)蒸馏水洗(3-5 次)双蒸水洗(3 次)烘干 5(0-60 摄氏度)牛皮纸包装(2)用过的玻璃仪器自来水浸泡洗涤剂刷洗(以后同新仪器清洗步骤一样)2.瓶盖洗涤剂刷洗自来水冲洗蒸馏水浸泡过夜双蒸水煮沸 2-3 次 1 次/10/min烘干牛皮纸包装3.剪刀镊子洗涤剂刷洗自来水冲洗蒸馏水冲洗酒精棉球擦拭(用双蒸水与酒精配制)牛皮纸包装4.试剂的除菌使用微孔滤膜除菌,可以除去细菌及 2/3 的支原体。二实验
3、方法取小鼠 B16 黑素瘤细胞株,用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基 10ml,在 37摄氏度 5%CO2恒温培养箱中培养;待细胞生长至将近铺满培养瓶底部时,停止培养;弃去培养液,用 PBS 液清 5ml 洗细胞 2 次,弃去 PBS 液;用含%的胰蛋白酶 1ml 消化细胞,于倒置显微镜下观察,待细胞收缩变圆时拿回操作台;瓶外用酒精棉球消毒,打开培养瓶盖,倒去消化液(先倒去的先吹打),酒精棉球吸去最后一滴消化液,盖上瓶盖放置 2-3min。打开准备好的培养基、带吸球的移液管,加培养基 20ml,对着细胞面加入,加的时候吸管口不可碰到培养瓶口,加完后进行吹打,注意不要有太多气泡,吹打成单细胞悬液(一般基本 5-7次),吹打完成后可取少量进行细胞计数;一般情况下,细胞长的较快,一瓶可以分成 3 瓶。打开经过消毒的瓶子,分装,盖上瓶盖,并标记是由哪一瓶分出来的(什么细胞、时间等),用封口膜封好,在倒置显微镜下观察后放入CO2 培养箱中培养。培养后 2h 观察一次,以后每天观察一次,一般 3 天完成一次传代培养。传至 5 代是就要进行冷冻一次。2
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