QIAamp Viral RNA Mini Kit中文说明书.pdf
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1、Q QI IA Aa am mp p V Vi ir ra al l R RN NA AM Mi in ni i K Ki it t 中中文文说说明明书书-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1大致流程:大致流程:QIAamp Viral RNA Mini Kit 利用了硅胶膜的选择吸附的特性,结合真空或分离柱处理,是同时纯化多个样品的理想选择。先将样品在高变性条件下裂解,灭活 RNase,确保病毒 RNA 的完整性。调节 buffer 至 QIAamp 膜吸附 RNA 的最佳条件,将样品转入 QIAamp Mini column。RNA 与膜结合,而其他污染物则用
2、两种不同的洗液分两步除去。用特殊的 Rnase-free 缓冲液洗脱得到的高质量的RNA,可以直接进行下游实验,也可储存备用。纯化产物无蛋白质,核酸,其他杂质和抑制剂污染。无需酚/氯仿抽提或酒精沉淀,QIAamp 膜就可以保证高纯,完整的 RNA 的极高回收率。所有缓冲液和试剂都保证是无 Rnase 污染的。注意:注意:1.样品如果是冷冻保存的,要避免反复冻融。否则会导致蛋白质变性沉淀,降低病毒效价,最终减少产量。此外,沉淀还会堵塞 QIAamp 膜。若产生了沉淀,可以通过 6800g,离心3min,小心吸取上清进行实验。2.在将样品放入 QIAamp 分离柱前,一定要将裂解液的条件调至病毒
3、RNA 的最佳吸附条件。如果起始样品量较大,超过了 140ul,那么最好分几次放入分离柱。3.如果样品中存在细胞 DNA,那么纯化过程中 DNA 会与病毒 RNA 一起提取出来。为避免此现象的发生,推荐用无细胞液体提取病毒 RNA。如果样品中含有细胞,如脑脊液,骨髓,尿液等,应该先过滤,或者 1500g 离心 10 分钟,然后取上清。如果 RNA,DNA 一起分离了出来,洗脱液可以用 Rnase-free 的 Dnase 进行消化,然后 70,15min 失活 Dnase。4.column 可以吸附大于 200 核苷酸的 RNA,产量取决于样品大小,样品保存和病毒效价。流程推荐的起始样品量为
4、140ul,不过 280ul 也是可以的。上柱前,小量的样品要用 PBS 调节到 140ul,而低效价的样品要先行浓缩到 140ul。对大于 140ul 的样品,上柱前所用的裂解液和试剂都应该相应增加,但用于洗涤步骤的缓冲液 AW1 和 AW2 通常无需改变。如果起始样品量比较多,建议将裂解样品分多次进行上柱。无需担心柱子会超载,纯化产物的质量也不会受影响。样品量超过 560ul 时,最好先浓缩样品。需准备的东西(分离柱法):需准备的东西(分离柱法):无水酒精(96100);离心管;灭菌,Rnase-free 枪头,离心机(适用于和 2ml 离心管)。试剂准备:试剂准备:1.吸取 310ul
5、buffer AVE 加入到装有 310ug 冷冻 carrier RNA 的管子中,配成 1ug/ul 的溶液。充分溶解后,将其分成合适的等份,20冻存。反复冻融不要多于 3 次。22.检查 buffer AVL 的沉淀情况,必要的话可置于 80温育至沉淀溶解。按照表 1 及公式计算一批样品所需的 buffer AVL-carrier RNA 混合物的体积(说明书 1516 页写的比较清楚,不再详述)。轻柔的颠倒混匀 10 次,不要涡旋,避免产生泡沫。(Note:buffer AVL-carrier RNA 应该现用现配,28可保存 48 小时。用前,存放时产生的沉淀必须在 80加热重新溶解
6、。溶解次数要小于 6 次。80加热不能超过 5min。)n x ml=y mly ml x 10 l/ml=z ln=number of samples to be processed simultaneouslyy=calculated volume of Buffer AVLz=volume of carrier RNABuffer AVE to add to Buffer AVL因此,carrier rna 溶解在 ave 之后就大概每管分装,或者也可。之后冻存,由于其冻融不能超过 3次。3.buffer AW1 在用前需按照瓶子上的说明,加入无水乙醇(96100)稀释。(52904 1
7、9ml AW1 需加入 25ml 乙醇)说明书 17 页4.buffer AW2 在用前需按照瓶子上的说明,加入无水乙醇(96100)稀释。(52904 13ml AW1 需加入 30ml 乙醇)说明书 17 页柱子的使用(分离柱法):柱子的使用(分离柱法):要避免交叉污染。1.2.3.4.5.6.7.样品上柱时要小心,不要弄湿柱子的边缘。在所有的移液步骤中注意要换枪头。枪头主要不要碰到 QIAamp 膜。斡旋后瞬时离心离心管,将盖子上的液体甩下来全程带手套,一旦手套接触到样品,立即更换手套。放入离心机离心前要盖上 column。将 column 和收集管从离心里拿出后,将 column 放入
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