《酶切连接与转化》PPT课件.ppt
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1、限制性酶切、连接与转化一、酶切一、酶切1、核酸酶的分类:、核酸酶的分类:核酸酶:核酸酶:通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,从而导致核酸分子多核核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。核酸酶可分为两类:核酸外切酶外切酶(exonuclease)是从核酸的一端开始,一个接一个把核苷酸水解下来;核酸内切酶内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3,5磷酸二酯键,将核酸链切断。?如果内切酶可以切掉入侵的病毒DNA,为什么它们不会破坏宿主细胞自身的DNA 限制修饰系统限制修饰系统 简称 R/M系统 restriction modification 类似于免疫体系,他能够识别自己的类似于免疫体系
2、,他能够识别自己的DNA和外和外来的来的DNA,并使外来的,并使外来的DNA降解。降解。由两种酶来控制:修饰的甲基转移酶和核酸限由两种酶来控制:修饰的甲基转移酶和核酸限制性内切酶。制性内切酶。当外源的含有限制性酶特定位点的核酸进入细当外源的含有限制性酶特定位点的核酸进入细胞时,相应的核酸限制性酶就会将其解。但是菌体胞时,相应的核酸限制性酶就会将其解。但是菌体内的很多核酸也同样含有这样的序列,这时特异的内的很多核酸也同样含有这样的序列,这时特异的甲基化酶就起作用了。甲基化酶在内源的部分核酸甲基化酶就起作用了。甲基化酶在内源的部分核酸还没被限制以前就被甲基化了,这种甲基化核酸序还没被限制以前就被甲
3、基化了,这种甲基化核酸序列是限制性酶无法作用的。列是限制性酶无法作用的。2 2、限制性酶切的原理:限制性酶切的原理:限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。3、限制性核酸内切酶的类型和主要特征:、限制性核酸内切酶的类型和主要特征:限制性酶切序列限制性酶切序列5 突出末端突出末端3 突出末端突出末端+5-CCCGGG-33-GGGCCC-55-CCC-OH3-GGG-pp-GGG-3OH-CCC-5SmaI平末端平末端粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端:DNA片段经限制性内切
4、酶切割后,在切割位点处所产生突出的5-或3-单链末端.识别序列限制性内切酶的特点 识别识别 4-8 bp 的回文序列的回文序列.常用的酶识别常用的酶识别 6 bp 发生的概发生的概率为率为 46=4096 bp/每次每次.(44=256 bp;48=65536 bp)1.高度特异性高度特异性2.商业化生产商业化生产3.反应需要反应需要Mg2+4.不同的内切酶可能产生相同的末端不同的内切酶可能产生相同的末端5 GAATTC 33 CTTAAG 5如如 EcoRI 识别序列识别序列:4.影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素 (1)DNA 纯度纯度 (2)DNA甲基化的程度甲
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