相对定量 ΔΔCT法和相对标准曲线法.pdf
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1、1The world leader in serving scienceModule 5:相对定量相对定量-CT法和相对标准曲线法法和相对标准曲线法2相对定量相对定量 PCR:相对基因表达量相对基因表达量3目的基因:Plat 1未处理 样本处理后 样本示例实验示例实验问题:样本处理后,目的基因的表达量有什么变化?4DRnCyclesCt=23Ct=24DCt=24 23=1未处理组:目的基因处理组:目的基因目的基因与目的基因与目的基因目的基因的比较的比较5DRnCycles未处理组:目的基因和内参基因处理组:目的基因和内参基因如果加入如果加入内参基因内参基因会怎样呢会怎样呢?DCt=23 13
2、=10Ct=24Ct=14Ct=13Ct=23DCt=24 14=106两种相对定量的方法两种相对定量的方法比较 Ct(Ct)法相对标准曲线法样本间的倍数关系样本间的倍数关系7TemplateCt目的基因内参基因ABCDEFGHIJ对应点相减A-F=Ct1如何选择相对定量的方法?如何选择相对定量的方法?8TemplateCt目的基因内参基因ABCDEFGHIJ对应点相减对应点相减如何选择相对定量的方法?如何选择相对定量的方法?A-F=Ct1B-G=Ct2C-H=Ct3D-I =Ct4E-J =Ct59在Excel中制作图表Ct1Ct2Ct3Ct4Ct5A-F=Ct1B-G=Ct2C-H=Ct3
3、D-I =Ct4E-J =Ct5Ct稀释点1 2 3 4 5如何选择相对定量的方法?如何选择相对定量的方法?10根据斜率选择一种定量方法比较 Ct(Ct)法斜率 0.1相对标准曲线法斜率 0.1如何选择相对定量的方法?如何选择相对定量的方法?11Ct 法法12Ct 法的必要条件法的必要条件两个基因(目的基因和内参基因)必须有相一致的扩增效率,并尽可能接近100%!13Ct法如何确认扩增效率法如何确认扩增效率每对引物一条标准曲线14实际实验中如何快速判断扩增效率是否一致实际实验中如何快速判断扩增效率是否一致同时扩增目的基因和内参基因,通过查看扩增曲线中指数增长期是否平行来确定扩增效率是否相似。1
4、5指数增长期的曲线平行说明扩增效率相似指数增长期的曲线平行说明扩增效率相似内参基因目的基因16Ct法结果计算法结果计算步骤步骤 2:其他其他样本样本和和对照样本对照样本比较比较DCt 处理样本 DCt 对照样本=DDDDCt步骤步骤 1:内参基因内参基因均一化样本差异均一化样本差异Ct 目的基因 Ct 内参基因=D DCt步骤步骤 3:使用公式计算使用公式计算2-DDDDCt倍数变化倍数变化=17目的基因和内参基因扩增效率不一致目的基因和内参基因扩增效率不一致另一个选择:预先确定每个基因的扩增效率18分析时,手动输入每个基因的扩增效率相对定量结果计算就会把每个基因的扩增效率计算进去目的基因和内
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