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1、Chapter 5 Genetic Recombination遗传重组遗传重组Outline:1.什么叫遗传重组?什么叫遗传重组?2.遗传重组的类型遗传重组的类型3.同源重组的分子机制同源重组的分子机制4.细菌的转化、接合和转导细菌的转化、接合和转导5.同源重组的酶学机制同源重组的酶学机制6.位点特异性重组位点特异性重组7.转座转座8.插入序列、复合转座子插入序列、复合转座子9.转座的分子机制转座的分子机制10.真核生物转座子真核生物转座子Mutation 突变突变个体基因个体基因 突变突变基因间交流基因间交流适者生存适者生存广广义义:任任何何造造成成基基因因型型变变化化的的基基因因交交流流过
2、过程程都都叫叫遗遗传重组传重组(genetic recombination)狭狭义义:涉涉及及DNA分分子子内内断断裂裂-复复合合的的基基因因交交流流,有有时时又又叫叫交交换换(crossing over)。DNA分分子子内内或或分分子子间间发发生生遗遗传传信信息息的的重重新新组组合合,称称为为遗遗传传重重组组(genetic recombination)。重重组组产产物物为为重重组组体体DNA(recombinant DNA)。Section 1 遗传重组概述遗传重组概述Outline of genetic recombination用于染色体上的基因作图(重组频率与基因之间用于染色体上的基
3、因作图(重组频率与基因之间的距离相关)的距离相关)培育转基因细胞和生物培育转基因细胞和生物重组原理的应用重组原理的应用Genetic recombinationHomologous Recombination同源重组同源重组Site-specific Recombination位点特异性重组位点特异性重组Transposition Recombination转座作用转座作用Illegitimate Recombination异常重组异常重组-指指发发生生在在姐姐妹妹染染色色单单体体之之间间或或同同一一染染色色体体上上含含有有同同源源序序列列的的DNA分分子子之之间间或或分分子子之之内内的的重重
4、新新组组合。合。-通通常常根根据据Holliday结结构构(holliday juncture structure)的的形形成成和和拆拆分分分分为为3个个阶阶段段,即即前前联联会会体阶段、联会体形成和体阶段、联会体形成和Holliday结构的拆分结构的拆分。Section 2 Homologous Recombination同源重组同源重组同同源源重重组组反反应应严严格格依依赖赖DNA分分子子之之间间的的同同源源性性100%同源同源-Homologous Recombination100%同源同源-Hemologous Recombination原核原核生物:通常放生在生物:通常放生在DNA复
5、制复制过程中过程中真核真核生物:常见于细胞周期的生物:常见于细胞周期的S期之后期之后Homologous recombination occurs between identical or nearly identical sequences.It is also called general recombination.同源重组需要满足的条件:同源重组需要满足的条件:(1)在交叉区域含有相同或几乎相同的碱基序列;)在交叉区域含有相同或几乎相同的碱基序列;(2)双链)双链DNA分子之间发生互补配对;分子之间发生互补配对;(3)需要重组酶的催化;)需要重组酶的催化;(4)形成异源双链;)形成异源
6、双链;(5)发生联会)发生联会 1.切断切断(nicking)2.链置换链置换(strand displacement)3.单链侵入单链侵入(single-strand invasion)4.噜噗切除噜噗切除(loop cleavage)5.链同化链同化(strand assimilation)6.异构化异构化(isomerization)7.分支迁移分支迁移(branch migration)一、同源重组的分子机制一、同源重组的分子机制(一)断裂(一)断裂-复合及复合及Holliday中间体中间体重重组组的的前前提提之之一一是是参参与与重重组组的的两两条条DNA分分子子必必须须靠靠近近,同同
7、源源序序列列之之间间严严格格配配对对,配配对对又又叫叫做做联联会会(synapsis)。DNA invading(recA)Branch migration (recA)DNA ligase535353535353535353535353535353535335535353Holiday intermediate53535353 endonuclease (recBCD)endonuclease (recBCD)5353535353535353Holliday intermediate5355533355553333535553335555333353555333 endonuclease(r
8、uvC)endonuclease(ruvC)DNA ligase DNA ligase patch recombinant splice recombinant电镜下的电镜下的Holliday结构结构 2012-3-1 ThursdayChengdu Medical College18以以上上讨讨论论的的是是两两个个完完整整的的双双螺螺旋旋DNA分分子子之之间间的的重重组组。重重组组也也可可以以发发生生在在一一个个完完整整双双螺螺旋旋DNA分子和分子和一个片段(单链的和双链的)一个片段(单链的和双链的)之间。之间。(二)细菌转化、接合和转导的重组机制(二)细菌转化、接合和转导的重组机制Bact
9、erial Conjugation has been defined as the transmission of genetic information from a donor bacterium to a recipient cell through cell-to-cell contact.(donor供体;供体;recipient受体)受体)1 Conjugation接合接合Conjugation processConjugation processConjugation processIntroduction of an exogenous DNA into a cell,caus
10、ing the cell to acquire a new phenotype.(exogenous外源的;外源的;phenotype形态)形态)2 Transformation转化转化TransformationTransformation experiment of Streptococcus pneumoniae Transduction is the transfer of DNA fragments from one bacterium to another bacterium by a bacteriophage.(exogenous外源的;外源的;phenotype形态)形态)3
11、 Transduction转导转导Transduction1.E.coli的的RecA蛋蛋白白是是一一个个39kDa的的单单肽肽链链,是是同同源源重重组组过过程程中中最最重重要要的的蛋蛋白白质质,也也叫叫重重组组酶酶(recombinase)2.作作用用:促促进进同同源源DNA联联会会和和促促进进DNA分分子子间间的的单链交换单链交换二、同源重组的酶学机制二、同源重组的酶学机制单链单链DNA结合活性结合活性双链双链DNA结合活性结合活性NTP酶活性酶活性促进互补单链复性的能力促进互补单链复性的能力RecA蛋白在同源重组的具体作用分为蛋白在同源重组的具体作用分为3个阶段个阶段:1.RecA的第一
12、个的第一个DNA结合位点(初级位点)与单结合位点(初级位点)与单链链DNA结合,包被结合,包被DNA,形成蛋白质,形成蛋白质-DNA丝丝状复合物;状复合物;2.RecA的第二个的第二个DNA结合位点(次级位点)与结合位点(次级位点)与1个双链个双链DNA分子结合,形成三链分子结合,形成三链DNA中间体,中间体,随后单链随后单链DNA侵入双链侵入双链DNA,寻找同源序列;,寻找同源序列;3.RecA催化链交换,由被催化链交换,由被RecA包被的单链包被的单链DNA从从53方向取代双链方向取代双链DNA分子之中的同源旧分子之中的同源旧链,形成异源双链,并发生分叉迁移链,形成异源双链,并发生分叉迁移
13、RecA蛋白促蛋白促进进2个双个双链链DNA分子分子链链之之间间的交的交换换RecA蛋白促蛋白促进单进单链链DNA与双与双链链DNA进进行行链链交交换换RecA蛋白蛋白单单体的体的三三维结维结构模型构模型RecBCD蛋白蛋白:1.由RecB、RecC和RecD三个亚基组成。2.具有5种酶的活性外切核酸酶V、解链酶、核酸内切酶、ATP酶和单链DNA外切酶;3.RecBCD蛋白参与细胞内的RecBCD同源重组途径首先它与双链DNA分子自由末端结合,依靠其外切核酸酶V的活性同时降解DNA的2条链,然而,一旦遇到chi()序列,RecD亚基就从复合物中释放出来,留下来的RecBC蛋白开始以解链酶的活性
14、发挥作用,在水解ATP的同时,解开DNA双链,产生单链DNA,为RecA发挥作用铺平道路,最终起动了链交换和重组反应RecBCD蛋白的作蛋白的作用模型用模型 RecF途径途径:这主要是质粒之间进行重组的途径,需这主要是质粒之间进行重组的途径,需要的蛋白质有要的蛋白质有RecA、RecJ、RecN、RecO、RecQ和和Ruv等等Site-specific recombination occurs at a specific DNA sequence.位点特异性重位点特异性重组发组发生在生在两条两条DNA的的特异位点特异位点上。上。The first example was found in t
15、he integration between l lDNA and E.coli DNA.Section 3 Site-specific Recombination位点特异性重组位点特异性重组DNA integration噬菌体的位点特噬菌体的位点特异性整合异性整合Transposition is the movement of specific pieces of DNA in the genome.转座过程中,转座成分从染色体的一个区段转座过程中,转座成分从染色体的一个区段转移转移到到另一另一 个区段或从一条染色体个区段或从一条染色体转移转移到另一条到另一条染染 色体。色体。由于转座作用总
16、是伴随着转座成分的复制,故又称由于转座作用总是伴随着转座成分的复制,故又称为为复制重组复制重组(replicative recombination)Section 4 Transposition转座作用转座作用Transposition resembles site-specific recombination being catalyzed by special enzymes.转座类似于位点特异性重组,只不过需要特殊酶的转座类似于位点特异性重组,只不过需要特殊酶的催化。催化。可转移成分现在一般叫做转座单元,简称可转移成分现在一般叫做转座单元,简称转座元(转座元(transposons),也
17、叫做),也叫做转座子转座子。虽然虽然“转移转移”,但是,但是“复制复制”-转座作用涉及转座子的复制转座作用涉及转座子的复制(replicative recombination),当一个拷贝插),当一个拷贝插入基因组的新位置后,原来位置上仍保留一个拷贝。入基因组的新位置后,原来位置上仍保留一个拷贝。和和同同源源重重组组及及位位点点特特异异性性重重组组不不同同,转转座座作作用用不不依依赖赖转转座座子子和和靶靶点点之之间间以以及及供供点点和和靶靶点点之之间间任任何何的序列同源性。的序列同源性。1 1 细菌中的转座作用细菌中的转座作用转座子转座子插入插入复制复制使靶点处基因失活;存在及复使靶点处基因失
18、活;存在及复制加重了细胞的生理负担制加重了细胞的生理负担基因缺失、倒位、易位;基因缺失、倒位、易位;作为袖珍同源区域允许重组发作为袖珍同源区域允许重组发生;某些细菌质粒进化的方式生;某些细菌质粒进化的方式细细菌菌中中的的转转座座成成分分依依组组成成结结构构可可以以分分为为:插插入入序序 列列(insertion sequences)、复复 合合 转转 座座 子子(composite transposons)、TnA转转 座座 子子 家家 族族(TnA family)和和 可可 转转 移移 噬噬 菌菌 体体(transposable phages)1.1.插入序列插入序列(insertion s
19、equences)ISinsertion sequences(IS)including:inverted terminal repeats(IR):1525bptransposase genedirect repeats:59bpIS TranspositionTransposase genetypes of IS transpositionduplicative transpositionConservative transpositionduplicative transpositionConservative transpositionIS的的转转座机制座机制IS的的结结构构transp
20、osonInsertion sequence+another gene(usually antibiotic gene)Transposase genetet-R geneTransposons Transposition2.2.复合转座子复合转座子(composite transposons)复复合合转转座座子子含含有有一一个个中中心心序序列列和和位位于于其其两两侧侧的的壁壁(IS或或类类IS)。中中心心序序列列含含有有抗抗药药性性基基因因等等遗遗传传信信息息。左左、右右两两个个壁壁在在序序列列上上相相似似,因因此此有有时时又又 叫叫长长 末末端端 重重复复(lengthy terminal
21、 repeat)。3.3.TnA转座子转座子家族家族(TnA family)较较长长,约约5000bp,比比IS长长的的多多。同同时时携携带带有有负负责责自自身身转转座座的的基基因因和和诸诸如如抗抗药药性性基基因因等等其他基因。两端没有其他基因。两端没有IS或类或类IS组件。组件。4.4.可转移噬菌体可转移噬菌体(Mu phages)以以E.coli为为寄寄主主的的温温和和噬噬菌菌体体,以以裂裂解解生生长和溶源生长两种交替方式之一繁衍自己。长和溶源生长两种交替方式之一繁衍自己。复合型复合型转转座子的座子的结结构构Mu噬菌体的噬菌体的结结构构真核生物的转座子真核生物的转座子根据转座的机理将真核生
22、物的转座子分为二类:第一类是反转座子,其转座过程是DNARNADNA,需要RNA中间体;第二类是DNA转座子,其转座过程是DNADNA,无RNA中间体。DNA转座子又分为复制型DNA转座子和保留型DNA转座子,其中,复制型在转位前后,原位置上的拷贝仍然存在,只是通过“复制”和“粘贴”的方式,复制一份到新的位点;而保留型在转座中,原来的拷贝被“剪切”后“粘贴”到新的位点,即原来的拷贝被原封不动地转移并保留到新的位点。每一类转座子都有自主型和非自主型。自主型转座子的内部含有开放的阅读框架,自己编码转座所必需的酶或蛋白质;非自主型转座子缺乏足够的编码能力,却保留了转座所必需的顺式元件,在合适的自主型
23、转座子编码的转座酶的作用下,它们照样可以进行转座。玉米的玉米的Ac-Ds系统系统McClintock在玉米基因组发现的Ac-Dc系统可谓是最有代表性的例子。Ac代表激活元件,属于自主型,带有全功能的转座酶基因;Ds代表解离元件,属于非自主型,带有缺失的转座酶基因,由Ac突变而来。Ac和Ds之间关系密切,一“主”一“仆”,Ds单独不能移位,因为它不能合成转座酶。同一个细胞内,必须有Ac的存在,Ds才会移动。如果Ac或Ds插入到玉米种子的紫色色素基因C内部,则紫色色素基因被关闭,使玉米籽粒不能产生紫色色素,而成为黄色;如果Ds从C内跳开,C所受的抑制作用即被解除,玉米籽粒又变成紫色;如果Ds跳到远
24、离Ac处,或者Ac本身跳开,Ds即不受Ac的控制,它又可以发挥对结构基因SG的抑制作用,使玉米籽粒成为黄色。Ac和Ds跳动得如此之快,使得受它们控制的颜色基因时关时开,于是玉米籽粒便出现了斑斑点点。反转座子反转座子反转座子在真核生物的基因组中占很高的比例,它在结构、性质和转位的方式上与逆转录病毒的复制很相似。首先是DNA被转录为RNA中间物,然后RNA中间物被逆转录成双链DNA,最后,双链DNA在新的位点上整合到基因组DNA上。根据两端的结构,反转座子可进一步分为LTR反转座子和非LTR反转座子:前者的两端是直接的长末端重复序列;后者无LTR序列,但有一端终止于1小段重复序列(通常是poly
25、A)。无论是哪一类,仍然有自主型和非自主型之分。如果是自主型的,其内部含有gag基因和pol基因,但缺乏编码外壳蛋白的env基因。pol基因能够编码蛋白酶、逆转录酶、核糖核酸酶H和整合酶;如果是非自主型的,则内部序列大小变化很大,缺乏大多数或者全部编码功能。反转座子在某种意义可视为有缺陷的逆转录病毒。转座的分子机制转座的分子机制“剪切”和“粘贴”机制“复制”和“粘贴”机制。转座酶转座酶(1)DDE-转座酶,这一类转座酶含有高度保守的三联体氨基酸残基,即Asp、Asp和Glu,这三个氨基酸残基是参与催化的2价金属离子(主要是Mg2+)与酶分子的配位结合所必需的;(2)Y2-转座酶,活性中心有2个Tyr残基参与催化;(3)Y-转座酶,活性中心1个Tyr残基参与催化;(4)S-转座酶,活性中心的Ser残基参与催化;(5)RT/En-转座酶,有逆转录酶和内切酶组合而成。由由DDE转转座座酶酶介介导导的的转转座子座子“剪切剪切”和和“粘粘贴贴”机制机制由由Y-转转座座酶酶或或S-转转座座酶酶介介导导的的转转座子座子“剪切剪切”和和“粘粘贴贴”机制机制转转座子的座子的“复制复制”和和“粘粘贴贴”机制机制反反转转座子的座子的转转座机制座机制
限制150内