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1、中药材黄曲霉素检测技术概述一、中药材质量安全现状中药材是中医防病治病的重要基础。中药材在田间生长、采收加工、储藏运输等各个环节都 会因污染霉菌而发生霉变。这些霉菌分泌的有毒代谢产物使中药材发霉变质,直接威胁到群 众的用药安全。中药中的霉菌毒素主要有黄曲霉毒素,赭曲霉素,玉米赤霉烯酮,展青毒素, 伏马毒素等。中药材的种类是影响真菌毒素污染的主要因素,易污染的中药材,在不同的温、 湿度条件下均可产生真菌毒素。温度和湿度条件也可以影响真菌毒素的增长,如:黄曲毒毒 素在不同的温、湿度条件下均可以产生;赭曲霉毒素需要在湿度较高的条件下才能产生。近年来,随着中药材在国际市场上的持续升温,其安全性越来越引起
2、人们的关注。真菌毒素残 留作为中药材微量外源性有毒有害物质,一般不表现出急性毒性,但通常有较强的蓄积性,致 癌、致畸、致突变作用明显,严重影响中药材的安全性。二、中药材真菌毒素控制相关国家法规近年来,各级食品药品监管部门不断加大中药监管力度,努力保持中药质量总体稳定。国家食品药品监督管理局关于规范中药生产经营秩序严厉查处违法违规行为的通知(国食药 监安2012187号文件)中,要求加强对黄曲霉毒素、重金属及有害元素、农药残留量等安 全性指标的检测和控制,切实保证中药材质量和安全,另要求企业具备与生产品种相适应的 检验设备和能力,严把质量检验关。国家药品安全“十二五”规划,规划中明确指出“开展药
3、品快速检验技术研究,搭建检 验技术共享平台”、“加快推进药品快速检验技术在基层的应用,配置快速检验设备”,“加强 县级机构快速检验能力建设”的要求。三、中药材真菌毒素检测工程及限量标准国家食品药品监督管理局对柏子仁、莲子、使君子、槟榔、麦芽、肉豆蔻、决明子、远志、 蕙饮仁、大枣、地龙、蝶蚣、水蛭、全蝎等14味药材及其饮片品种项下增加“黄曲霉毒素” 检杳工程,限度为“黄曲霉毒素B1不得过5 Pg/kg;黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄 曲霉毒素B2总量不得过10 U g/kg”。2010版药典附录IXV黄曲霉毒素测定采用高效液相色谱法,另外增补药典描述该法检 测建立增加柱后光化学衍生法。四、中
4、药材黄曲霉素检测方案介绍(一)仪器分析法特点优点缺点准确、灵敏、抗干扰性强,国家检测部门确实证方法。仪器本钱高、对操作人员技术要求高、操作复杂、耗时较长。免疫亲和柱-高效液相色谱法:符合2010版药典附录IX V中黄曲霉毒素测定高效液相色 谱法,另外增补药典描述该法检测建立增加柱后光化学衍生法。1.设备和耗材配置2,样品前处理:冠一为中药材提供不同的处理方案(详细方案请联系冠一,冠一开发了针对多 种中药材基质提供优化的处理方案).免疫亲和柱净化:*品名规格及您教tt9用途1高效乖相色话仪一台分析检测2英熠戏器一台读取灵光信号3亶函号需专用色遢柱150/250mm货号,PRC18一支配者各类色遢
5、仪.国画毒素检利用4GuanytBo&,174;雷笈毒毒素总量免疫亲和技3ml. 25支僮.快速过柱31.货号,IACO11-3假设干高料异性,纯化W本5GuanyiBio 174;KRC光化学柱后衍生反响装筑号,EQKRC一台适用于黄日*毒索检制6高连均质器到达22000rpm以上.货斗EQ-WR-1L一台M席惶.高速,均盾7GuanyiBnt&l 74;功加干缢哪lOOP.llOmm. 1 5pm 筑号.GMF-110一盒尊盲毒素专用过38GuanyiB& 174;八位某流提住柒货号,EQ-PUMP-8一台用于控制免投亲枝过往疣建g而曲寡毒素朝泗/ml国曲“石素B1, G1;0 5吁m
6、i黄曲热舞素B2 G2用于乙的,货号.STDriO81皿用于定量分析树4品睡制富集-洗涤-洗脱-收集全部洗脱液供化学衍生检测用。3 .化学衍生为什么使用光化学衍生器?由于黄曲霉具有较强的紫外吸收和产生荧光的特性,因此可以 进行HPLC-紫外或荧光检测,但是同时黄曲霉毒素中的Bl、G1由于其在含水的流动相中容 易产生荧光淬灭,因此在很多的实验中都会采用衍生法测定黄曲霉毒素。衍生的方法也很多: 有柱前的,柱后的,在线的,由于在线的柱后光化学衍生有明显的优势,所以现在被增补为 药典的检测方法,优势主要在于无需任何化学试剂、对人员无伤害;无需人员直接操作、避 免误差;无需担忧衍生液腐蚀检测器。4 .高
7、效液相色谱分析;a-KRC光化学衍生25被长,254 nmHPLC色谱柱;茵曲U海素专用C.18a谱柱150 x 4 6mm;源功相,甲醉冰4555file:/C:/Users/ADMINI-l/AppData/Locain,emp/ksohtmM96/wps2.png * *:前门进样体熟,2(U荧光校刊K,A羊发波长,365nmA-发射凝长,455 nmHPKltl.痣效德相色谢权帚和焚光检烟ah ii曲寡需素专用色谱柱C18 160x4.6 mm(-)酶联免疫法特点灵85良高.现时城、样本处理防承I单.对技术人员更果不高、检相稣低.可同时检利大批量样本,应用干大样本快速定量解查.可在一定
8、幅归性率(交叉反响率). 冠一推出的GuanylBkXR,曲/毒玄空成M盒且有粒高的灵触度划发3度,适用于大量祥*的定量分析.1 .方法原理采用直接竞争酶联免疫法,在微孔板上预包被黄曲霉毒素抗原,加入样本(或黄曲霉毒素标 准品溶液)及辣根过氧化物醵标记的黄曲霉毒素特异抗体。样本或标准品溶液中的抗原与预 包被在板孔上的抗原竞争结合酣标抗体。未结合的防标抗体在洗涤时被除去。再加入TMB 显色液,读取吸光值。样品吸光值与其所含黄曲霉毒素总量成负相关,与标准曲线比拟即可 得出样品中黄曲霉毒素总量的含量。2 .设备和试剂配置:品名配格及叁数数量用途1GuanyiBioR#曲霉毒素做量试剂食96T,灵的度
9、,0 Ippb 货号,EKT-011-M定量分析检测2GuanyiBioiS 心小柱25T净化得本3解标仪(酹联免疫检利仪)找光片,450nm一台配套各类色谓仪.毒面毒素检洌用3 .样本前处理:中药材:粉碎、提取、离心,取上清液加入GuanyiBio离心小柱进行净化。 为什么要用GuanyiBi。离心小柱?中药材的基质复杂,提取时样本液颜色较深,而且不容易 去除。有机试剂提取净化方法繁琐,试剂挥发对环境及人体造成危害,且净化效果不稳定。 用GuanyiBi。离心小柱,那么只需提取液离心过柱,即可去除提取液中的杂质,方便快捷,净 化效果好,且回收率可以到达85%以上。4 .检测步骤免疫反响30m
10、in;洗板5次:显色反响30min;终止反响,酶标仪读0D值。5 .分析结果的表述 用酶标仪判读结果。(三)免疫金标快速检测法 特点操作简单、费用低廉、耗时短、检冽快速.适用于样本快速定性初步赤查存在一定假阳性、微据不方便保存及分析.冠一推出的GuanyiBioTM黄曲霉毒素总量免疫金标快速检测条特异性好,适用于检测样本量 大;短时间出具检测结果并控制经费的情况,可以快速定性,初筛。 1.方法原理 黄曲霉毒素总量快速检测条应用了竞争抑制免疫层析的原理,样本中的黄曲霉毒素总量在酶 标孔中与胶体金标记的特异性抗黄曲霉毒素单克隆抗体结合,抑制了抗体和NC膜检测线上 AF-BSA偶联物的结合。如果样本
11、中黄曲霉素总含量大于0.5 ug/L,检测线不显颜色,结果 为阳性;反之,检测线显红色,结果为阴性。 2.设备和试剂配置序号 晶名规格及叁数数量用途25T 1GuanyiBioTM苗曲U素息量免疫金标快速检潴条检制限,lOppb一篇定性分析检洌货号,PR-0113.分析步骤:中药材粉碎溶解后取上清液检测。吸取样品滴加到加样孔中,8-15分钟读取结果。在C线显色的情况下:T线显色比C线深或一样深是阴性。T线显色比C线浅, 或无显色是阳性结果。五、温馨TIPS:1 .中药中真菌生长繁殖的有利条件主要是适宜的温度与水分。如能将中药贮存于10C以下, 水分保持在10%以下,就能有效地防霉。2 .从事真菌毒素科研及检测的人员,必须注意防护,如穿戴隔离衣帽,在进行真菌别离培 养工作时,应戴口罩,并尽量防止抱子飞扬。3 .操作台面如有漏溅,应立即用新配的5%次氯酸钠消毒。以5%次氯酸钠(NaOCI)处理 时,黄曲霉毒素于数秒钟内即被破坏,故是常用的消毒剂。4 .也有应用生物学方法解毒的报道,生物学方法本钱低,收效大,可能是一种有前途的除 毒措施。鉴于霉菌毒素对人体的危害,提醒各位奋斗在抗毒一线的老师们一定要注意保护自身安全哦!
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