荧光免疫技术.pdf
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1、临床检验技师考试辅导临床检验技师考试辅导第一节第一节概述概述临床免疫学和免疫检验临床免疫学和免疫检验第八章第八章荧光免疫技术荧光免疫技术荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。一、荧光的基本知识一、荧光的基本知识1.荧光:荧光就是某些物质受到一定波长光的激发后,在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的光。2.发射光谱:发射光谱是指固定激发光波长,在不同波长下所记录到的样品所发射的荧光强度谱图。激发态电子回到的能级不同,发出的荧光波长就不同。荧光物质在吸收光能后,即刻发射荧光,一旦停止供能,荧光随即消失。3.激发光谱:激发光谱是指固定检测发射光荧光波长,用不同波长的激发光照射样品所记录到的相
2、应的荧光发射强度谱图。4.荧光效率;在一定范围内,荧光强度与激发光强度呈正相关,即激发光越强,荧光越强,但过强的在一定范围内,荧光强度与激发光强度呈正相关,即激发光越强,荧光越强,但过强的激发光会使荧光很快褪去。激发光会使荧光很快褪去。5.荧光寿命:荧光物质被激发后产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间称为荧光寿命。6.荧光淬灭:荧光物质在某些理化因素(如紫外线照射、高温、苯胺、酚、I、硝基苯等)作用下,发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。7.荧光偏振。二、荧光物质二、荧光物质(一)荧光色素1.异硫氰酸荧光素(异硫氰酸荧光素(FITCFITC):为黄色或橙黄色结晶粉末,易溶于水或乙醇等溶剂。分子量
3、为389.4kD,最大吸收光波长为 490495nm,最大发射光波长为520530nm,呈现明亮的黄绿色黄绿色荧光。其主要优点是:人眼对黄绿色较为敏感;通常切片标本中的绿色荧光少于红色荧光。2.四乙基罗丹明(RB200):不溶于水,易溶于乙醇和丙酮。性质稳定,可长期保存。最大吸收光波长为 570nm,最大发射光波长为 595600nm,呈橘红色荧光。3.四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC):最大吸引光波长为550nm,最大发射光波长为 620nm,呈橙红色荧光。4.藻红蛋白(R-RE):最大吸引光波长为565nm,最大发射光波长为 578nm,呈明亮的橙色荧光。(二)其他荧光物质1.镧系螯合物:
4、其中以EuEu 应用最广。Eu 螯合物的激发光波长范围宽,发射光波长范围窄,荧光衰变时间长,最适合用于时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定。2.酶作用后产生荧光的物质:4-甲基伞酮-D 半乳糖苷本身无荧光,受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮,后者可发出荧光。其他如碱性磷酸酶的底物是4-甲基伞酮磷酸盐,辣根过氧化物酶的底物是对羟基苯乙酸等。第二节第二节荧光抗体技术荧光抗体技术荧光抗体技术是以荧光素标记抗体荧光素标记抗体,与切片中组织或细胞抗原反应,经洗涤分离后,在荧光显微镜下观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其部位,借此对组织细胞抗原进行定性和定位检测定性和定位检测,或对自身抗体进行定
5、性和滴度测定,此技术亦称荧光免疫组织化学技术。3 33第1页临床检验技师考试辅导临床检验技师考试辅导一、荧光抗体的制备一、荧光抗体的制备(一)抗体要求临床免疫学和免疫检验临床免疫学和免疫检验将荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成。一般需经纯化提取IgGIgG 后再作标记。(二)荧光素要求荧光素要求 异硫氰酸荧光素最常用异硫氰酸荧光素最常用要求:应具有能与蛋白质分子形成共价键共价键的化学基团,与蛋白质结合后不易解离不易解离,而未结合的色素及其降解产物易于清除;荧光效率高荧光效率高,与蛋白质结合后,仍能保持较高的荧光效率;荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明;与蛋白质结合后不影响不影响蛋白质原
6、有的生化与免疫性质;标记方法简单、安全无毒;与蛋白质的结合物稳定,易于保存。(三)抗体的荧光素标记1.搅拌标记法:以 FITC 标记为例。先将待标记的蛋白质溶液用0.5ml/L pH9.0 的碳酸盐缓冲液平衡,随后在磁力搅拌下逐滴加入FITC 溶液,在室温持续搅拌46 小时后,离心,上清液即为标志物。此法适用于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体溶液。优点是标记时间短、荧光素用量少。但本法的影响因素多,若操作不当会引起较强的非特异性荧光染色。2.透析法:适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液。此法标记比较均匀,非特异染色也较低。方法为:先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中,置于含FITC 的 0.
7、01mol/L pH9.4的碳酸盐缓冲液中反应过夜,以后再对 PBS 透析法去除游离色素。低速离心,取上清液。(四)荧光素标记抗体的纯化抗体标记完成后,还应对标记抗体作进一步纯化,以去除未结合的游离的荧光素。去除未结合的游离的荧光素。纯化方法可采用透析法或层析分离法。(五)荧光抗体的鉴定1.荧光素与蛋白质的结合比率 荧光素与蛋白的过量结合是非特异荧光着色的来源之一过量结合是非特异荧光着色的来源之一,而未结合者有抑制特异性荧光抗体反应的作用。荧光素结合到蛋白上的量的重要指标是荧光素与蛋白质的结合比率(荧光素与蛋白质的结合比率(F/PF/P)。荧光素与蛋白质的结合比率(F/P)是指荧光素(F)结合
8、到抗体蛋白(P)上的量。F/P 比值越大,表明抗体分子结合的荧光素越多,反之则结合越少。一般用于 组织切片组织切片的荧光抗体,其F/P1.51.5 为宜,用于活细胞染色活细胞染色以 F/P2.42.4 为宜。2.抗体效价 可以采用双向免疫扩散试验测定双向免疫扩散试验测定,抗原含量为 1g/L1g/L 时,抗体效价1:161:16 者较为理想。3.抗体特异性 吸收试验吸收试验:向荧光抗体中加入过量相应抗原过量相应抗原反应后,再用于阳性标本再用于阳性标本染色,应不出现明显荧光;抑制试验抑制试验:阳性标本先与相应未标记抗体反应先与相应未标记抗体反应,洗涤后,再加荧光抗体再加荧光抗体染色,荧光强度应受
9、到明显抑制。(六)荧光抗体的保存防止抗体失活和防止荧光淬灭。最好小量分装,-20冻存可保存 23 年。真空干燥后可长期保存。稀释后的抗体不宜长时间保存,在4可保存 13 天。二、标本的制作二、标本的制作组织材料可制备成石蜡切片(较少用)或冷冻切片,切片要求尽量薄些,以利于抗原抗体接触和镜检。组织标本也可制成印片,方法是用洗净的玻片轻压组织切面,使玻片粘上12 层组织细胞。第2页临床检验技师考试辅导临床检验技师考试辅导临床免疫学和免疫检验临床免疫学和免疫检验细胞或细菌可制成涂片,涂片应薄而均匀。过程中应保持抗原的完整性,并在操作中不发生溶解和变性,也不扩散至邻近细胞或组织间隙中去。三、荧光抗体染
10、色与结果判断三、荧光抗体染色与结果判断荧光抗体与抗原反应,一般在25253737,3030 分钟分钟,不耐热抗原的检测则以4过夜为宜。(一)直接法:用特异荧光抗体直接滴加于标本上。本法操作简便,特异性高,非特异荧光染色因素少;缺点是敏感度偏低,需制备特异性的荧光抗体。(二)间接法:可用于检测抗原和抗体,普通一抗荧光二抗一抗荧光二抗。灵敏度高,仅需一种荧光抗体。(三)双标记法:FITC 及罗丹明分别标记不同的抗体,而对同一标本作荧光染色。(四)荧光抗体染色结果判断:在每次实验时均需设立严格的实验对照(阳性和阴性对照)。阳性细胞的显色分布有胞质型、胞质型、胞核型和膜表面型三种类型胞核型和膜表面型三
11、种类型。临床上根据特异性荧光强度达“+”以上判定为阳性。“-”为无或仅见极微弱荧光;“+”为荧光较弱但清楚可见;“+”为荧光明亮;“+”为耀眼的强荧光。四、荧光显微镜的基本结构四、荧光显微镜的基本结构免疫荧光显微技术的基本原理是荧光抗体与待测标本中的组织或细胞抗原结合后,在荧光显微镜下观察,在黑色背景上可见明亮的特异性荧光即可对标本中的抗原物质进行鉴定。(一)光源 由于荧光物质的量子效率极低,要有一个很强的激发光源,通常用高压汞灯、氙灯或卤素灯作为激发光源。(二)滤光片 滤光片的正确选择是获得良好荧光观察效果的重要条件。滤光片分为隔热滤光片、激发滤光片和吸收滤光片。1.隔热滤光片 位于灯室的聚
12、光镜前面,能阻断红外线的通过而隔热。2.激发滤光片 位于光源和物镜之间,能选择性地透过紫外线可见波长的光域,以提供合适的激发光。3.吸收滤光片 位于物镜和目镜之间,作用是阻断激发光而使发射的荧光透过,使标本在暗的背景上呈现荧光易于观察,也使眼睛免受强激发光刺激。(三)光路 分为透射光和落射光两种形式。(四)聚光器 聚光器有明视野、暗视野和相差荧光聚光器等。(五)镜头 目镜有氟处理、消色差和复消色差三类镜头,常用的是消色差镜头。第三节第三节荧光免疫分析的类型荧光免疫分析的类型荧光免疫测定是将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合,用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度,对液体液体标本中微量
13、或超微量物质进行定量定量测定。一、时间分辨荧光免疫测定(一、时间分辨荧光免疫测定(TRFIATRFIA)用镧镧系元素标记抗原或抗体,用时间分辨技术测量荧光,同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨。(一)基本原理1.时间分辨:时间分辨:正常组织在激发光照射下可以发出一定波长的荧光,干扰检测结果。但该荧光寿命较短(110ns),而镧系元素螯合物的荧光寿命较长(101000s)。故待短寿命背景荧光完全衰变后再测定镧系元素离子螯合物的特异性荧光信号。2.StokesStokes 位移位移:选择荧光物质作为标志物时,必须考虑激发光谱和发射光谱的波长差激发光谱和发射光谱的波长差,即 Stokes 位移。3
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