图位克隆李金伟.pptx
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1、内容简要内容简要图位克隆技术的基本原理1图位克隆的一般步骤(考研)2图位克隆在植物基因分离中的应用3图位克隆的现状和前景4第1页/共37页图位克隆技术的基本原理图位克隆技术的基本原理图位克隆(Map-basedcloning)又称定位克隆(positionalcloning),1986年首先由剑桥大学的Alancoulson提出,是近几年来随着各种植物的分子标记图谱相继建立而发展起来的一种行的基因克隆的一种方法第2页/共37页图位克隆技术的基本原理图位克隆技术的基本原理基本原理:功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座,再利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上,用与目的基因紧密连锁的分子标
2、记筛选DNA文库(包括YAC,BAC,TAC或Cosmid等),从而构建基因区域的物理图谱,再利用此物理图谱通过染色体步(chromosome walking)逼近目的基因或通过染色体登陆(chromosome landing)方法最后找到包含有该目的基因的克隆,最后经过遗传转化试验证实目的基因功能。第3页/共37页图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤图位克隆的主要步骤(复旦大学2003细胞生物学考研试题)第4页/共37页图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤 2.12.22.4筛选与目的基因紧密连锁的分子标记目的基因的定位目的基因的筛选和鉴定 2.3构建高质量、容易操作的大片段基因组文库第5页
3、/共37页图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤2.1筛选与目的基因连锁的分子标记 筛选与目标基因连锁的分子标记(molecular markers)是实现基因图位克隆的关键。实质上,分子标记是一个特异的DNA片段或能够检出的等位基因,精确的分子标记能够极大地提高图位克隆的效率。迄今为止,已有几十种技术可用于分子标记的筛选,包括有:RFLP标记、RAPD标记、AFLP标记、SSLP标记、SSR标记、SNP标记等。其中最为常用的是简单序列长度多态性(SSLPs)和单核苷酸多态性(SNPs)第6页/共37页图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤SSLPsSSLPs SSLP是基于PCR的分子标记,检测
4、比较直接,只需要通过设计引物便可检测鉴定的SSLP标记最为常用的最为常用的分子分子标记标记SNPsSNPs SNPs标记的检测也比较直接,它是不同生态型之间基因组中的单个核苷酸的差别,这些差别的核苷酸通常位于不编码区域,常见的检测SNPs标记的方法主要是剪切扩增多态性序列(CAPS),它是基于PCR的第7页/共37页图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤图位克隆的分子标记示意图第8页/共37页图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤2.2目的基因的定位 目的基因的定位分为初定位和精细定位第9页/共37页图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤2.2.1初定位 目的基因初定位是利用分子标记在一个目标性状的
5、分离群体中把目的基因定位于染色体的一定区域内。初定位通常使用近等基因系法或群组分离分析法。近等基因系是指只有目标性状基因有差异其他性状基因相同的2个群体,可以通过连续回交的途径获得。群组分离分析法,将分离群体中的研究的目标性状根据其类型分成2组,将每组内一定数量的植株DNA等量混合,形成2个池,这2个池仅在目标性状上有差异。利用分子标记技术寻找2个池的扩增谱带的差异,这种多态性极可能与目标基因连锁。用所有的分离后代单株,验证该多态性是否真正与目标基因连锁及连锁距离的确定。如果分离群体不易获得,可采取混合样品法第10页/共37页图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤2.2.2精细定位(最艰难、最耗
6、时的限速步骤)在初步定位的基础上,接下来就要利用高密度的分子标记连锁图对目的基因区域进行区域高密度分子标记连锁分析以便精细定位目的基因。精细定位通常采用的方法是侧翼分子标记或者混合样品作图。第11页/共37页图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤侧翼分子侧翼分子标记标记指利用初步定位的目的基因两侧的分子标记,鉴定更大群体的单株来确定与目的基因紧密连锁的分子标记,Dixon等(1995)利用该方法已成功的将番茄的叶霉病基因Cf2精细定位到40kb的区间。侧翼分子标记需要对单个植株进行分析,工作效率低混合样混合样品作图品作图指在准确鉴定目的基因表型(单基因控制的隐性突变)的基础上,把大群体中单株突变
7、体分成若干组,以组为单位提取DNA,形成一个混合的DNA池进行分析,根据所有池中分子标记与目的基因发生的重组数来确定与目的基因连锁最紧密的分子标记及目的基因附近所有分子标记的顺序第12页/共37页图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤 一旦把目的基因定位在某染色体的特定区域后,接下来就要对其进行精细的作图。目前,作图的类型可分为2类,分别是遗传图谱和物理图谱。遗传图谱对图位克隆非常重要,尤其是精细的遗传图谱。增加遗传图谱上的分子标记数目是精细作图的基础,可以通过整合已有的遗传图谱,或者是寻找新的分子标记来实现。第13页/共37页图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤2.3构建高质量、容易操作的大片
8、段基因组文库 在基因的图位克隆技术中,高质量的基因组文库的构建也是克隆成功的关键。图位克隆的基因组文库主要有Cos质粒文库和人工染色体文库。Cos质粒是一种含有噬菌体的Cos位点的质粒载体,大小在57kb左右,可高效的地克隆2535kb的DNA片段。人工染色体的插入片段最长可达2Mb左右,能够覆盖完整的真核基因,最早发展的人工染色体是YAC。所以当要克隆大片段DNA时,需要YAC作载体。以YAC为载体,可将3001000kb的DNA片段克隆。因此以YAC为载体可以构建高等植物的完整基因组文库。第14页/共37页图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤2.4目的基因的筛选和鉴定2.4.1目的基因的筛
9、选 筛选和鉴定目的基因是图位克隆技术的最后一个关键环节。当一旦找到与目的基因紧密连锁的分子标记并鉴定出分子标记所在的大片段克隆后,就可以利用该克隆为探针进行染色体步移,逐渐靠近目的基因。第15页/共37页图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤 染色体步移是指利用已知的基因或分子标记来筛选大片段的DNA文库获得阳性克隆,如此得到的阳性克隆是“一步克隆”,再利用新获得的探针对文库进行第二次杂交,得到与探针具有重复序列的阳性克隆称为“二次克隆”,如此反复即可取到所需的克隆,获得目的基因。染色体步移的主要局限在于当必须经过一个无法克隆的片段时,步移的过程会被打断;当克隆的一端是重复序列时,步移的方向会发
10、生偏差。为克服这些弊端,Tanksley等(1995)又发展了染色体登陆的方法。第16页/共37页图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤 染色体登陆是找出与目的基因的物理距离小于基因组文库插入片段的平均距离还小的分子标记,通过筛选文库直接获得含有目的基因的克隆,他们利用此方法可很快将土豆的pto基因分离出来。在与目的基因紧密连锁的分子标记及大片段插入基因组文库都具备的情况下,就可以以该分子为探针通过菌落杂交,蓝、白斑挑选的方式筛选基因组文库而获得可能含有目的基因的阳性克隆。在用覆盖目的基因区域的大片段基因组DNA克隆筛选区域特异的cDNA后,仍需对目的基因编码的cDNA作进一步证实。第17页/共
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