《CR扩增产物的分析》PPT课件.ppt
《《CR扩增产物的分析》PPT课件.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《《CR扩增产物的分析》PPT课件.ppt(60页珍藏版)》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、PCR PCR 扩增产物的分析扩增产物的分析Gel electrophoresisRestriction endonucleaseMolecular hybridizationNucleic acid sequencePCRPCR扩增产物的电泳分析扩增产物的电泳分析琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳常用于常用于临床床检测(定性)(定性)聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比分离效果比琼脂糖好,条脂糖好,条带比比较集中集中可用于科研及可用于科研及检测分析分析琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法用的分离纯化和鉴
2、定核酸的方法琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物根据琼溶解温度,把琼脂糖分为一般琼脂糖和根据琼溶解温度,把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖熔点为低熔点琼脂糖熔点为6265,溶解后在,溶解后在37下维持液体状态约数小时,主要用于下维持液体状态约数小时,主要用于DNA片段片段的回收,质粒与外源性的回收,质粒与外源性DNA的快速连接等的快速连接等凝胶浓度选择琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)线型线型DNA分子的分离范围分子的分离范围(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12琼脂糖凝胶
3、的浓度与琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围分离范围电泳缓冲液电泳缓冲液 常用三种缓冲液常用三种缓冲液 Tris-硼酸(硼酸(TBE)Tris-乙酸(乙酸(TAE)Tris-磷酸(磷酸(TPE)TBE与与TPE:缓冲容量高,:缓冲容量高,DNA分离效果分离效果好,但好,但TPE在在DNA片段回收时含磷酸盐浓片段回收时含磷酸盐浓度高,容易使度高,容易使DNA沉淀沉淀TAE:缓冲容量低,但价格较便宜,因而:缓冲容量低,但价格较便宜,因而推荐选用推荐选用TAE。缓冲液中的。缓冲液中的 EDTA 可螯合可螯合二价阳离子,从而抑制二价阳离子,从而抑制DNA酶的活性,防酶的活性,防止止PCR扩增产物降解扩增产
4、物降解10TBE10TBE缓冲液的配制缓冲液的配制配方配方Tris 108克克克克硼酸硼酸 55克克H2O至至 1000mlpH应为应为临用时用水稀至临用时用水稀至TBE(20倍稀释)倍稀释)核酸电泳的指示剂核酸电泳的指示剂指示剂:指示剂:溴酚兰溴酚兰二甲苯青二甲苯青溴酚兰:在碱性液体中呈紫兰色溴酚兰:在碱性液体中呈紫兰色电泳中,溴酚兰的迁移率与双链线性电泳中,溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段片段琼脂糖凝琼脂糖凝胶浓度胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb核酸电泳的指示剂核酸电泳的指示剂二甲苯青:水溶液呈兰色,二甲苯青:水溶液呈兰色,电泳时,其迁移速
5、率与双链线性电泳时,其迁移速率与双链线性DNA大大致相当致相当琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率迁移率2Kb1.6Kb载样缓冲液载样缓冲液指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液组成载样缓冲液作用:作用:增加样品密度,使其比重增加,以增加样品密度,使其比重增加,以确保确保DNA均匀沉入加样孔内均匀沉入加样孔内在电泳中形成肉眼可见的指在电泳中形成肉眼可见的指示带,可预测核酸电泳的速度和位置示带,可预测核酸电泳的速度和位置使样品呈色,使加样操作更方便使样品呈色,使加样操作更方便核酸电泳的染色剂核酸电泳的染色剂最常用的染色剂最常用的染色剂溴化乙锭溴
6、化乙锭银染色银染色核酸电泳的染色剂核酸电泳的染色剂溴化乙锭(溴化乙锭(ethidium bromide,EB)是一种荧光染料,是一种荧光染料,EB分子可嵌入核酸双链的碱分子可嵌入核酸双链的碱基对之间,在紫外线激发下,发出红色荧光基对之间,在紫外线激发下,发出红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为可在凝胶电泳液中加入终浓度为ug/ml的的EB,有,有时亦可在电泳后,将凝胶浸入该浓度的溶液中染时亦可在电泳后,将凝胶浸入该浓度的溶液中染色色1015min琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶EB染色,肉眼可见核酸电泳带,其染色,肉眼可见核酸电泳带,其DNA量一般量一般5ng溴化乙锭太多,凝胶染色过深,核酸电泳带看不溴化
7、乙锭太多,凝胶染色过深,核酸电泳带看不清时,可将凝胶放入蒸馏水浸泡清时,可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察后再观察核酸电泳的染色剂核酸电泳的染色剂银染色:银染色液中的银离子银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核可与核酸形成稳定的复合物,然后用还原剂如甲醛酸形成稳定的复合物,然后用还原剂如甲醛使使Ag+还原成银颗粒,可把核酸电泳带染色还原成银颗粒,可把核酸电泳带染色黑褐色黑褐色主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色,也用于主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色,也用于琼脂糖凝胶染色琼脂糖凝胶染色灵敏度比灵敏度比EB高高200倍,但银染色后,倍,但银染色后,DNA不不宜回收宜回收电泳电泳电泳装置电泳装置
8、电泳仪电泳仪电泳槽电泳槽灌胶模具等灌胶模具等电泳仪电泳仪普通电泳仪普通电泳仪高压电泳仪高压电泳仪电泳槽电泳槽水平平板水平平板垂直平板垂直平板电泳方法电泳方法用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净,放在用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净,放在水平桌面上,并架好梳子水平桌面上,并架好梳子根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶,一般脂糖凝胶,一般 200400 bp 的的DNA片段片段(可配制(可配制1.7%)电泳方法电泳方法配制琼脂糖凝胶及倒胶配制琼脂糖凝胶及倒胶TBE电泳缓冲液电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中,称于三角烧瓶中,称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波取
9、一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化,冷却至炉内加热熔化,冷却至60(需要时可加入需要时可加入EB),倒入电泳槽中,待凝固,倒入电泳槽中,待凝固向电泳槽中倒入向电泳槽中倒入0.5 TBE,其量以没过胶,其量以没过胶面面2mm为宜,小心移去梳子(如样品孔内为宜,小心移去梳子(如样品孔内有气泡,应除去)有气泡,应除去)电泳方法电泳方法上样与通电上样与通电在在DNA样品中加入体积的载样缓冲液,混匀样品中加入体积的载样缓冲液,混匀后,加入样品孔内后,加入样品孔内接通电源,一般红色为正极黑色为负极,切接通电源,一般红色为正极黑色为负极,切记记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔样品由负极往正
10、极泳动(靠近加样孔的一端为负),电压为的一端为负),电压为1 5V/cm(长度以(长度以两个电极之间的距离计算)两个电极之间的距离计算)根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳,根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳,一般一般 200400bp 的的PCR产物产物50V电压,电泳电压,电泳2040min电泳方法电泳方法结果观察结果观察紫外仪上观察电泳带及其位置紫外仪上观察电泳带及其位置并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的的DNA片段和片段和DNA序列
11、分析序列分析其装载的样品量大,回收其装载的样品量大,回收DNA纯度高,长纯度高,长度仅相差度仅相差0.2%(即(即500bp中的中的1bp)的核苷)的核苷酸分子即能分离酸分子即能分离聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体,在催化剂由丙烯酰胺单体,在催化剂TEMED(N,N,N,N一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下,丙烯酰胺聚合形成长链,聚丙烯作用下,丙烯酰胺聚合形成长链,聚丙烯酰胺链在交联剂,酰胺链在交联剂,N,N一亚甲双丙烯酰胺一亚甲双丙烯酰胺参与下,聚丙烯胺链与链之间交叉联接而参与下,聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶形成凝胶聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙
12、烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的的浓度决定的不同浓度丙烯酰胺和不同浓度丙烯酰胺和DNADNA有效分离范围有效分离范围 丙烯酰胺丙烯酰胺(%)有效分离范围有效分离范围(bp)溴酚兰溴酚兰*二甲苯青二甲苯青*3.510020001004605.080500652608.0604004516012.040200307015.025150156020.0101001245材料材料电泳仪器:电泳仪器:电泳仪电泳仪垂直电泳槽及其附件垂直电泳槽及其附件.30%丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺,丙烯酰胺,29克克N,N一亚甲基双丙烯酰胺,一亚甲基双丙烯酰胺,1克克H2O,加至,加至100ml装于
13、棕色瓶内,装于棕色瓶内,4可保存二个月可保存二个月材料材料10%过硫酸铵过硫酸铵过硫酰铵,过硫酰铵,1克,加水至克,加水至 10 ml4可保存一周,可保存一周,-20可保存一个月可保存一个月1TBE电泳缓冲液电泳缓冲液TEMED(四甲基乙烯基二胺)(四甲基乙烯基二胺)聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳配胶:根据分离配胶:根据分离DNA片段的大小及需凝胶片段的大小及需凝胶的容积,配制聚丙烯酰胺凝胶的容积,配制聚丙烯酰胺凝胶按要求装配好垂直电泳板,两块玻璃板的两按要求装配好垂直电泳板,两块玻璃板的两侧及底部用侧及底部用1%的琼脂糖封边,防止封闭不的琼脂糖封边,防止封闭不严而使聚丙
14、烯酰胺液漏出严而使聚丙烯酰胺液漏出将装好的玻璃电泳板倾斜成将装好的玻璃电泳板倾斜成4560角角按表按表3配制所需配制所需%浓度凝胶的毫升数浓度凝胶的毫升数加入加入TEMED后,立即混匀,缓缓倒入两玻后,立即混匀,缓缓倒入两玻璃板间的胶床中,直到液体接近溢出时为止璃板间的胶床中,直到液体接近溢出时为止聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳立即插入适当的梳子,密切注意防止梳齿立即插入适当的梳子,密切注意防止梳齿下产生气泡,用一有力下产生气泡,用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上,然后将的夹将梳子夹在一边的玻璃板上,然后将玻璃板斜靠在物体上,使成玻璃板斜靠在物体上,使成10角,可减少角
15、,可减少液体泄漏的机会液体泄漏的机会室温聚合一小时后,将玻璃板插入电泳槽室温聚合一小时后,将玻璃板插入电泳槽中,上紧,倒入中,上紧,倒入TBE缓冲液缓冲液聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳小心取出梳子,立即用缓冲液冲洗加样孔,小心取出梳子,立即用缓冲液冲洗加样孔,因为梳子取出后,梳子上吸附的及凝胶顶部因为梳子取出后,梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合,产未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合,产生不规则的表面,将导致以后生不规则的表面,将导致以后DNA电泳带型电泳带型不规则不规则将将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后,加样品与适量的载样缓冲液混匀后,加到样品
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- CR扩增产物的分析 CR 扩增 产物 分析 PPT 课件
限制150内