《植物蛋白质组学》PPT课件.ppt
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1、第一篇分子与细胞生物学基础第三章植物蛋白质组学目录1.蛋白质组和蛋白质组学2.蛋白质组和基因组3.植物蛋白质组的研究方法3.1蛋白质双向电泳3.2氨基酸序列测定3.3质谱3.4生物信息学4.植物蛋白质组学的研究进展4.1植物发育蛋白质组学的研究4.2植物环境蛋白质组学的研究4.3磷酸化蛋白质组学的研究5.植物蛋白质组学研究的前景和挑战5.1表达的整体分析以及蛋白质组编目5.2大规模的蛋白质功能研究5.3建立完整的蛋白质调控网络1.蛋白质组和蛋白质组学v蛋白质组:由一个基因组所表达的所有蛋白质。v蛋白质组学:研究在特定时间或环境下某个细胞或某种组织的基因组所表达的全部蛋白质。它不是按照传统的方式
2、孤立地研究某种蛋白质分子的功能,而是应用各种蛋白质组学技术研究某种蛋白质在复杂的细胞环境中的功能。蛋白质组学分为表达蛋白质组学和细胞图谱蛋白质组学。前者利用各种先进技术研究蛋白质表达的整体变化,即研究在机体的生长发育、疾病和死亡的不同阶段中,细胞与组织的蛋白质组分的变化;后者主要通过分离蛋白质复合物系统地研究蛋白质间的相互作用2.蛋白质组和基因组蛋白质组和基因组的关系:它们在概念上有相关性,代表某一蛋白质组的蛋白质是由基因组编码的,而基因的功能是通过蛋白质表现出来的。蛋白质组学研究远比基因组研究复杂:蛋白质组学研究远比基因组研究复杂:(1)蛋白质组的复杂性远远高于基因组一个基因一个转录产物一个
3、蛋白质基因不同的转录起始和mRNA的剪切不同的mRNA不同的翻译起始不同的蛋白质翻译后修饰蛋白质的功能、稳定性、细胞定位发生变化(2)基因组的组成是固定的,蛋白质组的组成是动态的。基因组在所有细胞中几乎都是相同的,与之不同,蛋白质组具有很高的细胞和组织特异性。基因组是相对稳定的,蛋白质组处于高度动态变化之中。(3)细胞内蛋白质的拷贝数(108)远比基因拷贝数大(105)。(4)基因可采用PCR扩增和自动测序,而蛋白质还没有这些技术。3.1蛋白质双向电泳3.2氨基酸序列测定3.3质谱技术3.4生物信息学3.植物蛋白质组的研究方法蛋白质组研究的技术路线流程图3.1蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳(2-
4、DE):根据蛋白质的等电点和相对分子质量的不同,分别通过第一维等电聚焦和第二维SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白质混合物进行分离。电泳后对蛋白质进行染色,常用的染色方法有考马斯亮蓝染色、银染以及蛋白质荧光检测方法。蛋白质双向电泳图3.1.1利用双向电泳研究植物蛋白质组的基本流程蛋白样品提取蛋白样品提取双向电泳分离蛋白双向电泳分离蛋白蛋白质染色蛋白质染色双向电泳图谱分析双向电泳图谱分析蛋白点切割蛋白点切割蛋白酶解和鉴定蛋白酶解和鉴定该流程最关键的步骤是蛋白质样品的提取,它关系到下游蛋白质的分离和鉴定是否能够成功。好的蛋白质样品要求从某一个细胞、组织或器官中提取尽可能多的蛋白质,以最大限度地反应这个蛋
5、白质组的全貌。3.1.2双向电泳的缺陷和解决方法解决方法:1.对样品进行前期分级2.对不同的细胞器官或组织进行分离3.使用宽胶条,符合重叠窄IPG凝胶4.双向荧光差异凝胶电泳5.多块胶垂直二维SDS-PAGE系统6.双向电泳工作站缺陷缺陷分辨率低分辨率低重复性差重复性差耗时、自动化耗时、自动化程度低程度低蛋白质蛋白质定量困难定量困难通过使用不同强度的离液剂和表面去垢剂,并进行分步溶解分离,可以获得更多的蛋白质,同时降低蛋白质样品的复杂性,提高2-DE的分辨率。如:ReadyPrep顺序抽提试剂盒。ReadyPrep试剂盒所需样品量较少,不需要额外的设备,是一种既节省时间又节省设备的好方法。Re
6、adyPrep产品线包含一系列2-DE样品制备试剂盒,不仅适用于通用样品(总蛋白)处理,而且可以将复杂样品按特定方法分级。处理通用样品的试剂盒包括总蛋白抽提和蛋白净化(clean-up)。样品分级试剂盒可用来降低样品复杂程度,同时有助于低丰度蛋白的富集和鉴定。这类试剂盒又分为两种,一种是基于蛋白不同的亚细胞定位来分离,另一种是对细胞总蛋白进行分级。下面的流程图将帮您确定哪种试剂盒对您更适合。一一.对样品进行前期分级对样品进行前期分级顺序抽提试剂盒可将样品分离成3个递增溶解度组份。这3个分离份依次分离,使我们能观察到其它方法观察不到的蛋白。通过对每一分离份逐级使用更强的去垢剂,可提供递增的溶解度
7、.试剂一试剂二试剂三二、对不同的细胞或组织进行分离通过亚细胞分类,比如单独提取细胞壁、细胞核、细胞膜、线粒体和叶绿体等的蛋白质组分。优点:降低蛋白质样品的复杂性,提高分辨率,了解蛋白质的定位。三、使用宽胶条,符合重叠窄IPG凝胶2-DE的分辨率通常认为与有效的分离面积成正比,使用宽分离距离的IPG胶和长距离的二维SDS-PAGE可以提高2-DE的分辨率。选用不同pH范围的胶条,通过重叠几次窄范围的IPG凝胶电泳结果,可以提高在某一区段尤其是蛋白质集中区段内的分辨率pH范围上样量40ug80ug120ug四.双向荧光差异凝胶电泳原理:双向荧光差异凝胶系统(DIGE)在传统双向电泳技术的基础上,结
8、合了多重荧光分析的方法,在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品,分析它们之间的差异性。极大地提高了结果的准确性,可靠性和重复性。五.多块胶垂直二维SDS-PAGE系统优点:提高二维电泳效率和实验重复性六.2-DE工作站优点:提高以2-DE为基础的蛋白质组研究的自动化程度和工作效率3.2氨基酸序列测定氨基酸测序主要使用的是N端测序-Edman化学降解法。降解反应分三步进行:第一步:偶联反应,降解试剂(PITC)与多肽链的游离氨基作用,形成PCT-肽。第二步:环化断裂反应,PCT-肽在无水强酸介质如三氟乙酸中,最靠近PTC基的肽键将发生断裂,同时PTC-氨基酸残基环化成ATZ衍生物。第三
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