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1、色谱柱的选择博纳艾杰尔科技第1页,共30页,编辑于2022年,星期二影响影响C18色色谱谱柱性能的主要因素柱性能的主要因素色谱柱与色谱填料的特性色谱柱与色谱填料的特性1、柱填料柱填料 硅胶纯度 粒径 比表面积 孔径2、色色谱谱柱的构型柱的构型 色谱柱直径 色谱柱长度3、固定相固定相 键合类型 残余硅羟基的影响 反相键合相的保留行为 键合硅胶的稳定性物理因素物理因素化学因素化学因素第2页,共30页,编辑于2022年,星期二柱填料对色谱柱性能的影响柱填料对色谱柱性能的影响第3页,共30页,编辑于2022年,星期二柱填料柱填料对对C18色色谱谱柱性能的影响:硅胶柱性能的影响:硅胶纯纯度度I2.3-二
2、羟基萘2.7-二羟基萘 TF=1.31Brand W,AQ Column 5m,4.6mm150mm Brand Z,C18 Column 5m,4.6mm150mm Venusil MP C18 5m,4.6mm150mm Brand H,C18 Column 5m,4.6mm150mm Brand U,C18 Column 5m,4.6mm150mm!TF=1.42TF=1.39TF=1.69TF=?流流动动相:相:甲醇:水=65:35流速:流速:1 mL/min温度:温度:35检测检测波波长长:230 nm 进样进样量:量:20 L硅胶纯度金属含量硅胶纯度金属含量第4页,共30页,编辑于
3、2022年,星期二柱填料柱填料对对C18色色谱谱柱性能的影响:硅胶柱性能的影响:硅胶纯纯度度II 硅胶纯度金属含量硅胶纯度金属含量d第5页,共30页,编辑于2022年,星期二柱填料柱填料对对C18色色谱谱柱性能的影响:粒径柱性能的影响:粒径 硅胶粒径和类型对柱效的影响硅胶粒径和类型对柱效的影响d硅胶粒径和类型对压力的影响硅胶粒径和类型对压力的影响第6页,共30页,编辑于2022年,星期二柱填料柱填料对对C18色色谱谱柱性能的影响:粒径柱性能的影响:粒径II 目前市场主要可供选择的填料粒径目前市场主要可供选择的填料粒径 1.7m,1.8m,2.2m 快速液相色谱柱:匹配快速色谱仪 2.7m 多孔
4、壳层:在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo)3.0m,3.5m 普通快速分析 5.0m 常规分析颗粒越小,柱效越高颗粒越小,柱效越高,但是耐污染性能下降,柱压升高但是耐污染性能下降,柱压升高.第7页,共30页,编辑于2022年,星期二柱填料柱填料对对C18色色谱谱柱性能的影响:比表面柱性能的影响:比表面积积 l 每克填料的表面积,与粒度,孔径有关每克填料的表面积,与粒度,孔径有关l比表面积大,保留增加,载样量增加,平衡时间增比表面积大,保留增加,载样量增加,平衡时间增加加(梯度洗脱尤为注意梯度洗脱尤为注意)l 根据需要选择合适的比表面积根据需要选择合适的比表面积第8页,共30页,编辑于20
5、22年,星期二柱填料柱填料对对C18色色谱谱柱性能的影响:孔径柱性能的影响:孔径I l 多孔材料的多孔材料的95%以上表面在以上表面在孔内部孔内部l 样品分子直径小于平均孔径,样品分子直径小于平均孔径,才能进入微粒内部才能进入微粒内部l 孔径至少是样品流体学直径的孔径至少是样品流体学直径的4倍倍l 300孔径用于:超过孔径用于:超过50个氨个氨基酸的肽或基酸的肽或25个残基的低聚寡个残基的低聚寡核苷酸核苷酸样品分子直径小于平均孔径,才样品分子直径小于平均孔径,才能进入微粒内部能进入微粒内部第9页,共30页,编辑于2022年,星期二柱填料柱填料对对C18色色谱谱柱性能的影响:孔径柱性能的影响:孔
6、径II 小生物分子的保留值在小孔径填料通常更大小生物分子的保留值在小孔径填料通常更大条件:C8色谱柱,4.6150mm,3.5um,A溶剂,0.1%TFA水溶液;B溶剂,0.1%TFA于80%乙腈水中;20min梯度,1030%B;60C,1.5ml/min第10页,共30页,编辑于2022年,星期二色谱柱的构型对色谱柱性能的影响色谱柱的构型对色谱柱性能的影响第11页,共30页,编辑于2022年,星期二色色谱谱柱的构型柱的构型对对色色谱谱柱性能的影响:柱性能的影响:长长度和直径度和直径色谱柱尺寸色谱柱尺寸 对色谱分离的影响:对色谱分离的影响:短柱短柱(15-100mm)-运行时间短运行时间短,
7、柱压低柱压低 长柱长柱(150-250mm)-分辨率高分辨率高,运行时间长运行时间长 窄径柱窄径柱(2.1mm)-检测器灵敏度高检测器灵敏度高 宽径柱宽径柱(3-21.2mm)-载样量高载样量高第12页,共30页,编辑于2022年,星期二固定相对色谱柱性能的影响固定相对色谱柱性能的影响第13页,共30页,编辑于2022年,星期二固定相固定相对对色色谱谱柱性能的影响:柱性能的影响:键键合合类类型型A 纵纵向交向交联联:保留和选择不稳定B 横向交横向交联联:宽pH适用,Durashell,C 单单体体键键合:合:重现性好,柱效高D 单单体(空体(空间间保保护护):):低pH稳定(Venusil A
8、SB)第14页,共30页,编辑于2022年,星期二固定相固定相对对色色谱谱柱性能的影响:残余硅柱性能的影响:残余硅羟羟基的影响基的影响残余硅羟基的影响残余硅羟基的影响普通硅胶普通硅胶当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时,表面的硅羟基会带负电荷,碱性化合物拖尾。解决方法解决方法封尾双层表面修饰第15页,共30页,编辑于2022年,星期二固定相固定相对对色色谱谱柱性能的影响:残余硅柱性能的影响:残余硅羟羟基的影响基的影响封尾封尾键合填料与小硅烷进行后续反应,如三甲基氯硅烷,反应掉部分残余硅羟基,以增加表面覆盖率。缺点:缺点:不能完全反应(仍有50%的硅羟基未被反应)在pHC3C1,长链之间
9、差别不大 第21页,共30页,编辑于2022年,星期二固定相固定相对对色色谱谱柱性能的影响:反相柱性能的影响:反相键键合相的保留行合相的保留行为为不同厂家色谱柱的不同厂家色谱柱的保留值,选择性与峰型保留值,选择性与峰型色谱柱:4.6*150mm,流动相:乙腈0.05M磷酸钾缓冲液,pH3.2(65:35);流速:1ml/min,拖尾峰 T0(尿嘧啶)P:吡啶L:苯酚N:N,N-二甲基苯胺B:4-丁基苯甲酸J:甲苯第22页,共30页,编辑于2022年,星期二固定相固定相对对色色谱谱柱性能的影响:柱性能的影响:键键合硅胶的合硅胶的稳稳定性定性键合硅胶的稳定性键合硅胶的稳定性 低pH值,键合相流失
10、高pH值,硅胶溶解影响色谱柱寿命,方法不重现 第23页,共30页,编辑于2022年,星期二固定相固定相对对色色谱谱柱性能的影响:柱性能的影响:键键合硅胶的合硅胶的稳稳定性定性低低pH值,键合相流失值,键合相流失第24页,共30页,编辑于2022年,星期二固定相固定相对对色色谱谱柱性能的影响:柱性能的影响:键键合硅胶的合硅胶的稳稳定性定性空间位阻保护,延缓键合相流失空间位阻保护,延缓键合相流失空间位阻键合代表产品:空间位阻键合代表产品:Venusil ASB C18Zorbax SB C18第25页,共30页,编辑于2022年,星期二固定相固定相对对色色谱谱柱性能的影响:柱性能的影响:键键合硅胶
11、的合硅胶的稳稳定性定性高高pH值,硅胶基质溶解值,硅胶基质溶解pH9时,色谱柱的稳定性时,色谱柱的稳定性第26页,共30页,编辑于2022年,星期二固定相对色谱柱性能的影响:固定相对色谱柱性能的影响:键合硅胶的稳定性键合硅胶的稳定性碳杂化,延硅胶缓高碳杂化,延硅胶缓高pH值水解值水解表面碳表面碳杂杂化化Agela Durashell RP表面碳表面碳杂杂化示意化示意图图第27页,共30页,编辑于2022年,星期二博纳艾杰尔为您提供全面的博纳艾杰尔为您提供全面的LC解决方案解决方案2010版药典LC方法开发服务全面的色谱柱选择低pH条件色谱柱(pH=0.8)Venusil ASB C18高pH条件色谱柱(pH=1-12)Durashell C18亲水色谱柱Venusil MP C18经济性通用色谱柱Odyssil C18色谱柱第28页,共30页,编辑于2022年,星期二总结:如何选择色谱柱总结:如何选择色谱柱了解目标化合物的性质了解色谱柱的性质粒径,孔径,比表面积,pH适用范围第29页,共30页,编辑于2022年,星期二有问题吗,谢谢大家!联系我:杨定忠联系我:杨定忠15611983289dz_第30页,共30页,编辑于2022年,星期二
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