基因工程与克隆技术.ppt
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1、学案学案 基因工程与克隆技术基因工程与克隆技术核心术语核心术语(记准、写准、理解透,把握内涵和外延记准、写准、理解透,把握内涵和外延)1.基因工程(限制性核酸内切酶、基因工程(限制性核酸内切酶、DNA连接酶、载体、目连接酶、载体、目的基因、基因表达载体、农杆菌转化法、显微注射法、感的基因、基因表达载体、农杆菌转化法、显微注射法、感受态细胞)受态细胞)2.蛋白质工程(预期功能、分子设计、蛋白质工程(预期功能、分子设计、DNA合成)合成)3.植物细胞工程植物组织培养(脱分化、再分植物细胞工程植物组织培养(脱分化、再分 化、愈伤组织、丛芽)、植物体细胞杂交(原生体融合、化、愈伤组织、丛芽)、植物体细
2、胞杂交(原生体融合、杂种细胞、杂种植株)杂种细胞、杂种植株)4.动物细胞工程动物细胞培养(原代培养、传代培动物细胞工程动物细胞培养(原代培养、传代培养、细胞株、细胞系)、动物细胞核移植、动物细胞融合养、细胞株、细胞系)、动物细胞核移植、动物细胞融合(杂种细胞、单克隆抗体)(杂种细胞、单克隆抗体)基因工程相关知识整合基因工程相关知识整合 概述基因工程和蛋白质工程基本操作过概述基因工程和蛋白质工程基本操作过程,并思考下列问题。程,并思考下列问题。答案答案 基因工程基本操作过程:获取目的基因基因工程基本操作过程:获取目的基因构建构建基因表达载体基因表达载体将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞
3、目的基因目的基因的检测与鉴定。的检测与鉴定。蛋白质工程基本操作过程:蛋白质预期功能蛋白质工程基本操作过程:蛋白质预期功能蛋白质蛋白质的三维结构的三维结构 氨基酸序列的多肽链氨基酸序列的多肽链基因(基因(DNA)分子分子设计设计DNA合成合成(1)基因工程诞生的理论基础和技术支持分别是什)基因工程诞生的理论基础和技术支持分别是什么?么?答案答案 理论基础:理论基础:DNA是遗传物质;是遗传物质;DNA双螺旋结双螺旋结构和中心法则的确立;遗传密码的破译。构和中心法则的确立;遗传密码的破译。技术支持:基因转移载体的发现;工具酶的发明;技术支持:基因转移载体的发现;工具酶的发明;DNA体外重组的实现;
4、重组体外重组的实现;重组DNA表达实验的成功。表达实验的成功。(2)基因工程的基本操作步骤中哪几处用到了限制)基因工程的基本操作步骤中哪几处用到了限制酶,其特性和来源是什么?又有哪几处涉及碱基互补酶,其特性和来源是什么?又有哪几处涉及碱基互补配对?配对?答案答案 限制酶在第限制酶在第1、2步中用到而且要求同一种,目步中用到而且要求同一种,目的是产生相同的黏性末端;限制酶主要从原核生物中的是产生相同的黏性末端;限制酶主要从原核生物中分离纯化而来,它能识别分离纯化而来,它能识别DNA分子的某种特定的核分子的某种特定的核苷酸序列,并且切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键,苷酸序列,并且切割两个核苷酸之间的
5、磷酸二酯键,产生的末端有黏性末端和平末端;只有第三步将目的产生的末端有黏性末端和平末端;只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对,其余三个步骤基因导入受体细胞不需碱基互补配对,其余三个步骤都涉及碱基互补配对。都涉及碱基互补配对。(3)基因表达载体如何构建?)基因表达载体如何构建?答案答案(4)将目的基因导入受体细胞的常用方法?)将目的基因导入受体细胞的常用方法?答案答案 植物细胞:农杆菌转化法;动物细胞:显微注植物细胞:农杆菌转化法;动物细胞:显微注射法;微生物:射法;微生物:Ca2+处理法。处理法。(5)目的基因的导入与表达如何进行检测与鉴定?)目的基因的导入与表达如何进行检测与鉴定
6、?答案答案 分子水平检测分子水平检测a.导入检测:导入检测:DNA分子杂交技术,即使用放射性同位分子杂交技术,即使用放射性同位素标记的含目的基因的素标记的含目的基因的DNA片段作探针检测。片段作探针检测。b.表达检测表达检测个体生物学水平鉴定:对转基因生物进行抗虫或抗个体生物学水平鉴定:对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验。病的接种实验。转录检测:分子杂交法,即目的基因作转录检测:分子杂交法,即目的基因作 探针与探针与mRNA杂交杂交翻译检测:抗原翻译检测:抗原抗体杂交法抗体杂交法 (09沈阳质检)转基因植物油是由转基沈阳质检)转基因植物油是由转基因植物通过压榨或浸出法加工制得的,因其出油率高
7、因植物通过压榨或浸出法加工制得的,因其出油率高而被广泛采用。我国是植物油消费大国,每年都从国而被广泛采用。我国是植物油消费大国,每年都从国外进口大量的转基因植物油。外进口大量的转基因植物油。(1)在培育转基因油料植物的过程中,基因操作需)在培育转基因油料植物的过程中,基因操作需要的工具酶是要的工具酶是 。在基因表达载体中,目的基因的首端必须含有在基因表达载体中,目的基因的首端必须含有 ,它是,它是 识别和结合位点。识别和结合位点。(2)请写出一种将目的基因导入油料植物细胞可以)请写出一种将目的基因导入油料植物细胞可以采用的方法:采用的方法:。若受体细胞为植物体细胞,可采用。若受体细胞为植物体细
8、胞,可采用 技术获得转基因植物体,该技术所依据技术获得转基因植物体,该技术所依据的原理是的原理是 。限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶和DNA连接酶连接酶启动子启动子RNA聚合酶聚合酶农杆菌转化(或基因枪、花粉管通农杆菌转化(或基因枪、花粉管通道)法道)法植物组植物组织培养织培养植物细胞全能性植物细胞全能性(3)若要检测()若要检测(2)中获得的植物细胞染色体上是)中获得的植物细胞染色体上是否含有目的基因,可采用否含有目的基因,可采用技术。而想技术。而想要得知上述植物是否真的出油率高,应如何做?要得知上述植物是否真的出油率高,应如何做?。(4)若利用蛋白质工程继续提高油料植物的出油率,)若利用
9、蛋白质工程继续提高油料植物的出油率,其设计流程应从预期的其设计流程应从预期的 出发,设计预期的出发,设计预期的 结构,推测出应有的结构,推测出应有的 序列,然后序列,然后找到相对应的找到相对应的 序列,再用转基因技术序列,再用转基因技术改变其现有性状。改变其现有性状。DNA分子杂交分子杂交将该植物制出植物油与同等质量的非转基因植物制出将该植物制出植物油与同等质量的非转基因植物制出的植物油称重比较的植物油称重比较蛋白质功能蛋白质功能蛋白质蛋白质氨基酸氨基酸脱氧核苷酸脱氧核苷酸关键信息关键信息 “工具酶工具酶”、“植物细胞植物细胞”、“原理原理”、“染色染色体上体上”、“预期预期”知识依据知识依据
10、 基因工程和蛋白质工程基因工程和蛋白质工程完整分析完整分析 (1)转基因植物的培育过程中,基因工)转基因植物的培育过程中,基因工具酶是限制性核酸内切酶和具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶,目的基因连接酶,目的基因只有含有启动子,才能被只有含有启动子,才能被RNA聚合酶识别并与之结聚合酶识别并与之结合进行转录。(合进行转录。(2)接受目的基因的受体细胞若为植)接受目的基因的受体细胞若为植物体细胞,可采用植物组织培养技术获得转基因植物。物体细胞,可采用植物组织培养技术获得转基因植物。(3)通过对比转基因植物与普通的非转基因植物的)通过对比转基因植物与普通的非转基因植物的出油率,可得知转基因植物是
11、否真的出油率高。出油率,可得知转基因植物是否真的出油率高。(4)蛋白质工程设计流程是:预期蛋白质的功能)蛋白质工程设计流程是:预期蛋白质的功能设计预期的蛋白质结构设计预期的蛋白质结构推出应有的氨基酸序列推出应有的氨基酸序列找找到相应的脱氧核苷酸序列。到相应的脱氧核苷酸序列。植物组织培养和植物体细胞杂交植物组织培养和植物体细胞杂交 图示植物组织培养和植物体细胞杂交过程,图示植物组织培养和植物体细胞杂交过程,并思考下列问题。并思考下列问题。(1)上述两过程依据的原理是什么?)上述两过程依据的原理是什么?答案答案 植物组织培养:细胞全能性;植物体细胞杂交:植物组织培养:细胞全能性;植物体细胞杂交:细
12、胞膜的流动性和细胞的全能性。细胞膜的流动性和细胞的全能性。(2)在植物体细胞杂交过程中,原生质体经诱导剂处)在植物体细胞杂交过程中,原生质体经诱导剂处理后,会有几种细胞类型?理后,会有几种细胞类型?答案答案 5种:甲、乙、甲甲、乙乙、甲乙种:甲、乙、甲甲、乙乙、甲乙 野生马铃薯品种的植株具有较强的抗病、野生马铃薯品种的植株具有较强的抗病、抗虫、抗盐碱、抗寒能力,但块茎不能食用。俄、德、抗虫、抗盐碱、抗寒能力,但块茎不能食用。俄、德、芬兰专家共同做实验研究,用野生马铃薯与马铃薯的芬兰专家共同做实验研究,用野生马铃薯与马铃薯的体细胞进行杂交,培育出了生活能力强的杂交系马铃体细胞进行杂交,培育出了生
13、活能力强的杂交系马铃薯。据图分析回答问题:薯。据图分析回答问题:(1)过程植物细胞原生质体的分离需经过酶解,其中过程植物细胞原生质体的分离需经过酶解,其中“酶解酶解”所用的酶应该包括所用的酶应该包括 。(2)过程可用聚乙二醇(过程可用聚乙二醇(PEG),其目的是),其目的是 。(3)请用文字和箭头表示出)请用文字和箭头表示出技术过程的实验流程:技术过程的实验流程:。由此过程。由此过程可以看出植物细胞有形成完整个体的可能性,这是可以看出植物细胞有形成完整个体的可能性,这是 。(4)在培养基上培养一段时间后,原生质体会再生出细)在培养基上培养一段时间后,原生质体会再生出细胞壁。可以取样,通过胞壁。
14、可以取样,通过 实验来实验来鉴别细胞壁是否已经再生。鉴别细胞壁是否已经再生。纤维素酶、果胶酶纤维素酶、果胶酶诱导原诱导原生质体融合生质体融合融合细胞融合细胞 愈伤组织愈伤组织 幼苗幼苗脱分化脱分化再分化再分化植物植物细胞具有全能性的表现细胞具有全能性的表现植物细胞的质壁分离与复原植物细胞的质壁分离与复原(5)请说明运用植物体细胞杂交法的最大好处:)请说明运用植物体细胞杂交法的最大好处:。可以可以克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍关键信息关键信息 “酶酶”、“聚乙二醇聚乙二醇”、“文字和箭头文字和箭头”、“细胞壁细胞壁”知识依据知识依据 植物体细胞杂交植物体细胞杂交
15、完整分析完整分析 (1)若去掉细胞壁而获得原生质体,需)若去掉细胞壁而获得原生质体,需用纤维素酶和果胶酶来处理。(用纤维素酶和果胶酶来处理。(2)用聚乙二醇处理)用聚乙二醇处理原生质体,可以诱导原生质体融合。(原生质体,可以诱导原生质体融合。(3)分别分别为脱分化和再分化过程,能够形成一个完整植株,体为脱分化和再分化过程,能够形成一个完整植株,体现出植物细胞的全能性。(现出植物细胞的全能性。(4)可以通过质壁分离与)可以通过质壁分离与复原实验来鉴别原生质体是否再生出细胞壁。(复原实验来鉴别原生质体是否再生出细胞壁。(5)植物体细胞杂交最大好处在于可以克服远缘杂交不亲植物体细胞杂交最大好处在于可
16、以克服远缘杂交不亲和的障碍。和的障碍。图图示示动动物物细细胞胞培培养养、细细胞胞核核移移植植和和单单克克隆隆抗体制备过程,并思考以下问题。抗体制备过程,并思考以下问题。动物组织工程技术的相关知识整合动物组织工程技术的相关知识整合(1)上述过程的原理是什么?)上述过程的原理是什么?答案答案 动物细胞培养:细胞增殖;动物细胞培养:细胞增殖;细胞核移植细胞核移植:细胞核全能性;细胞核全能性;单克隆抗体的制备原理:单克隆抗体的制备原理:a.免疫原免疫原理:经免疫的理:经免疫的B淋巴细胞产生特异性抗体。淋巴细胞产生特异性抗体。b.增殖原增殖原理:骨髓瘤细胞能在体外培养的条件下大量增殖。理:骨髓瘤细胞能在
17、体外培养的条件下大量增殖。c.融合原理:细胞膜的流动性以及病毒对宿主细胞的融合原理:细胞膜的流动性以及病毒对宿主细胞的穿透性。穿透性。(2)区分原代培养和传代培养、细胞株和细胞系。)区分原代培养和传代培养、细胞株和细胞系。答案答案 原代培养:可有两种表述。原代培养:可有两种表述。a.细胞悬浮液第一细胞悬浮液第一次在瓶中培养,没有分瓶培养之前的细胞培养;次在瓶中培养,没有分瓶培养之前的细胞培养;b.第第1代细胞的培养与传代细胞的培养与传10代以内的细胞培养统称为原代代以内的细胞培养统称为原代培养。两种表述没有本质区别。培养。两种表述没有本质区别。传代培养:同样有两种表述。传代培养:同样有两种表述
18、。a.细胞悬浮液培养一段细胞悬浮液培养一段时间后,分瓶再进行的细胞培养;时间后,分瓶再进行的细胞培养;b.传传10代以后的细代以后的细胞培养,统称为传代培养。胞培养,统称为传代培养。细胞株:原代培养的细胞一般传至细胞株:原代培养的细胞一般传至10代左右会出现代左右会出现生长停滞,衰老死亡,少数度过生长停滞,衰老死亡,少数度过“危机危机”的细胞能传的细胞能传4050代,形成细胞株。细胞株的遗传物质并没有发代,形成细胞株。细胞株的遗传物质并没有发生改变。生改变。细胞系:细胞株传至细胞系:细胞株传至50代以后,会出现第二次危机,代以后,会出现第二次危机,少数度过第二次危机的细胞能够无限制地传下去,形
19、少数度过第二次危机的细胞能够无限制地传下去,形成细胞系。细胞系的遗传物质发生了改变,有癌细胞成细胞系。细胞系的遗传物质发生了改变,有癌细胞的特点。的特点。(3)单克隆抗体制备过程中有哪两次筛选?)单克隆抗体制备过程中有哪两次筛选?答案答案 第一次筛选是将未融合的第一次筛选是将未融合的B细胞、骨髓瘤细胞细胞、骨髓瘤细胞以及以及BB融合、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰,融合、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰,筛选出筛选出B瘤融合的细胞。瘤融合的细胞。第二次筛选是将产生特定抗体的杂交瘤细胞通过细胞第二次筛选是将产生特定抗体的杂交瘤细胞通过细胞培养用相应抗原检测的办法筛选出来。因为从体内获培养用相应
20、抗原检测的办法筛选出来。因为从体内获取的免疫过的取的免疫过的B淋巴细胞有很多种,形成的杂交瘤细淋巴细胞有很多种,形成的杂交瘤细胞有很多种,所以需筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞有很多种,所以需筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。胞。(09潍坊质检)人潍坊质检)人CD20单克隆抗体是治单克隆抗体是治疗一些恶性肿瘤的特效药物,目前主要是通过培养哺疗一些恶性肿瘤的特效药物,目前主要是通过培养哺乳动物细胞的方式生产。我国科学家已经培育出世界乳动物细胞的方式生产。我国科学家已经培育出世界上第一头转入了上第一头转入了CD20抗体基因的转基因牛,可以从抗体基因的转基因牛,可以从它产的牛奶中直接提取它产的牛奶中直接
21、提取CD20抗体。这项技术成熟后,抗体。这项技术成熟后,有望使这一特效药的生产成本降至现在的有望使这一特效药的生产成本降至现在的1/10。请回。请回答:答:(1)单克隆抗体的制备过程需先将)单克隆抗体的制备过程需先将 融合,这一过程的诱导融合,这一过程的诱导方法与植物体细胞杂交不同的是方法与植物体细胞杂交不同的是。(2)动物细胞培养需要在含)动物细胞培养需要在含 混混合气体的培养箱中进行,培养液中通常需加入合气体的培养箱中进行,培养液中通常需加入 等一些天然成分。等一些天然成分。经过免疫的经过免疫的B淋淋巴细胞和骨髓瘤细胞巴细胞和骨髓瘤细胞用灭活病毒诱导用灭活病毒诱导血清、血清、血浆血浆95%
22、空气加空气加5%CO2(3)转基因技术的核心是)转基因技术的核心是。该。该过程用到的工具酶有过程用到的工具酶有 和和 。基因表达载体的构建基因表达载体的构建限制性核酸内切酶(限制酶)限制性核酸内切酶(限制酶)DNA连接酶连接酶关键信息关键信息 “单克隆抗体单克隆抗体”、“植物体细胞杂交植物体细胞杂交”、“混合气体混合气体”、“天然成分天然成分”、“核心核心”、“工具酶工具酶”知识依据知识依据 单克隆抗体、植物体细胞杂交、动物细胞单克隆抗体、植物体细胞杂交、动物细胞培养、转基因培养、转基因完整分析完整分析 单克隆抗体的制备首先是将经过免疫的单克隆抗体的制备首先是将经过免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞
23、融合,其诱导方法与植物体细淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,其诱导方法与植物体细胞杂交不同的是用灭活的病毒诱导。动物体细胞培养胞杂交不同的是用灭活的病毒诱导。动物体细胞培养需要满足以下条件:无菌无毒的环境、营养、温度和需要满足以下条件:无菌无毒的环境、营养、温度和pH以及气体环境。气体环境必须是含以及气体环境。气体环境必须是含95%的空气加的空气加5%的的CO2,O2是细胞代谢所必需的,是细胞代谢所必需的,CO2是维持培是维持培养液的养液的pH。在使用合成培养基培养动物细胞时,由。在使用合成培养基培养动物细胞时,由于人们对一些细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚,于人们对一些细胞所需的营养物质还没有完全
24、搞清楚,因此通常需加入血清、血浆等一些天然成分。转基因因此通常需加入血清、血浆等一些天然成分。转基因技术的核心是基因表达载体的构建,用到的工具酶是技术的核心是基因表达载体的构建,用到的工具酶是限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶和DNA连接酶。连接酶。1.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞生物种类生物种类 植物细胞植物细胞 动物细胞动物细胞 微生物细胞微生物细胞 常用方法常用方法 农杆菌转化法农杆菌转化法 显微注射技术显微注射技术 Ca2+处理法处理法 受体细胞受体细胞 体细胞体细胞 受精卵受精卵 原核细胞原核细胞 转化过程转化过程 将目的基因插将目的基因插入到入到Ti质粒的质粒的T-
25、DNA上上农农杆菌杆菌导入植导入植物细胞物细胞整合整合到受体细胞的到受体细胞的DNA表达表达 将含有目的基因将含有目的基因的表达载体提纯的表达载体提纯取卵(受精卵)取卵(受精卵)显微注射显微注射受受精卵发育精卵发育获得获得具有新性状的动具有新性状的动物物 Ca2+处理细胞处理细胞感受态细胞感受态细胞重组表达载重组表达载体与感受态细体与感受态细胞混合胞混合感受感受态细胞吸收态细胞吸收DNA分子分子 2.动物细胞融合与植物体细胞杂交的不同动物细胞融合与植物体细胞杂交的不同项目项目 动物细胞融合动物细胞融合 植物体细胞杂交植物体细胞杂交原理原理细胞膜的流动性细胞膜的流动性 细胞膜的流动性及细胞膜的流
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