《转化与扩增》PPT课件.ppt
《《转化与扩增》PPT课件.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《《转化与扩增》PPT课件.ppt(64页珍藏版)》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、第二章 分子克隆单元操作2.2 2.3 2.1 克隆载体克隆载体DNADNA的体外重组(切与接)的体外重组(切与接)目的基因的克隆目的基因的克隆2.4 转化与扩增(转与增)转化与扩增(转与增)转化子的筛选与重组子的鉴定(检)转化子的筛选与重组子的鉴定(检)2.5 基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程切切接接转转增增检检一、用于基因转移的受体(宿主)一、用于基因转移的受体(宿主)二、转化与扩增二、转化与扩增2.3 2.3 转化与扩增转化与扩增转化与扩增转化与扩增一、用于基因转移的受体(宿主)一、用于基因转移的受体(宿主)分子克隆用宿主应具备的条件分子克隆用宿主
2、应具备的条件各种基因工程受体(宿主)的特性各种基因工程受体(宿主)的特性实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工程受体1 1、分子克隆用宿主应具备的条件、分子克隆用宿主应具备的条件限制性缺陷型限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷(外切酶和内切酶活性缺陷(hsdRhsdR-)重组整合缺陷型重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞用于基因扩增或高效表达的受体细胞(recArecA-,recBrecB-,recCrecC-)具有较高的转化效率具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染,生物武器除外防止重组细菌扩散污
3、染,生物武器除外 野生型细菌一般不能作为受体细胞,需要进行改造野生型细菌一般不能作为受体细胞,需要进行改造基因工程主要宿主系统 原核细胞原核细胞(Prokaryotic)真菌(真菌(Fungus )昆虫昆虫(Baculovirus)高等真核细胞(高等真核细胞(Eukaryotic)人(基因治疗)人(基因治疗)动、植物(基因农场)动、植物(基因农场)2 2、各种基因工程受体(宿主)的特性、各种基因工程受体(宿主)的特性1 1)大肠杆菌)大肠杆菌 遗传背景清楚,载体受体系统完备,生长迅速,培养简遗传背景清楚,载体受体系统完备,生长迅速,培养简单,重组子稳定。单,重组子稳定。适用于外源适用于外源DN
4、ADNA的扩增和克隆、基因文库的构建和外源基的扩增和克隆、基因文库的构建和外源基因的高效表达,是因的高效表达,是DNADNA重组实验和基因工程的主要受体菌重组实验和基因工程的主要受体菌。产生结构复杂、种类繁多的内毒素。产生结构复杂、种类繁多的内毒素。各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性2 2)枯草芽孢杆菌)枯草芽孢杆菌 遗传背景清楚,蛋白质分泌机制健全遗传背景清楚,蛋白质分泌机制健全 ,生长迅速,培,生长迅速,培养简单,不产内毒素养简单,不产内毒素 适用于重组蛋白与多肽、特别是微生物来源的酶的高效适用于重组蛋白与多肽、特别是微生物来源的酶的高效分泌表达,。分泌表达,。遗传欠稳定,载体受
5、体系统欠完备遗传欠稳定,载体受体系统欠完备各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性3 3)链霉菌)链霉菌抗生素的主要生产者,相对操作简便,不产内毒素抗生素的主要生产者,相对操作简便,不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定,生长相对缓慢遗传不稳定,生长相对缓慢各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性4 4)酵母菌)酵母菌 具有真核生物的特征,遗传背景清楚,生长迅速,培养具有真核生物的特征,遗传背景清楚,生长迅速,培养简单,外源基因表达系统完善,遗传稳定简单,外源基因表达系统完善,遗传稳定 适用于外源适用于外源DNADNA的扩增、克隆以及真核生物基因的
6、高效的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究,是表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究,是DNADNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌重组实验和基因工程重要的真核性受体菌 内源性蛋白产物种类繁多且含量高内源性蛋白产物种类繁多且含量高各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性5 5)昆虫细胞(家蚕,杆状病毒表达系统)昆虫细胞(家蚕,杆状病毒表达系统)具有真核生物的特征,外源基因表达量高,繁殖相对较具有真核生物的特征,外源基因表达量高,繁殖相对较快,培养成本低廉,遗传稳定快,培养成本低廉,遗传稳定 适用于真核生物基因的高效表达适用于真核生物
7、基因的高效表达 DNADNA重组操作系统欠完善重组操作系统欠完善各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性6 6)哺乳动物细胞(中国)哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢细胞仓鼠卵巢细胞 CHOCHO)与人的亲缘关系近,表达系统完善,具有合适的糖基化与人的亲缘关系近,表达系统完善,具有合适的糖基化修饰系统修饰系统 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产,是的生产,是DNADNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体 细胞培养条件苛刻,生长缓慢细胞培养条件苛刻,生长缓慢 各种基因工程受体的特性各种基因工程受
8、体的特性7 7)植物细胞(拟南芥菜、烟叶)植物细胞(拟南芥菜、烟叶)农作物的经济意义重大,转基因植物细胞易于分化,细农作物的经济意义重大,转基因植物细胞易于分化,细胞培养简单且成本低廉,具有光合作用胞培养简单且成本低廉,具有光合作用 适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产,适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产,农作物品质的改良农作物品质的改良 遗传操作繁琐遗传操作繁琐 3 3、实验室常用的基因工程受体(宿主)、实验室常用的基因工程受体(宿主)大肠杆菌大肠杆菌用于接受质粒:用于接受质粒:C600C600、W3110W3110、HB101HB101、JM83JM83、DH5D
9、H5、JM101JM101(ApApss、TcTcss、CmCmss)用于接受用于接受l l-DNA-DNA:LE392LE392、ED8654ED8654 真菌真菌哺乳动物细胞哺乳动物细胞 CHO CHO 毕赤酵母、汉森酵母、毕赤酵母、汉森酵母、啤酒酵母啤酒酵母酵母菌:酵母菌:丝状真菌:丝状真菌:黑曲霉、青霉黑曲霉、青霉二、二、转化和扩增(转与增)转化和扩增(转与增)转化的原理与技术转化的原理与技术转化率转化率转化细胞的扩增转化细胞的扩增几个基本概念几个基本概念感受态(感受态(compentent)compentent):受体受体(宿主)细胞经过一些理化或生物学方法处理后,细胞膜宿主)细胞经
10、过一些理化或生物学方法处理后,细胞膜的通透性发生暂时性的改变,成为能允许外源的通透性发生暂时性的改变,成为能允许外源DNADNA进入的一进入的一种生理状态。种生理状态。感受态细胞(感受态细胞(compentent cell)compentent cell)转化(转化(transformation)transformation):外源外源DNADNA导入特定受体(宿主)细胞,并使之繁殖和表达的操作。导入特定受体(宿主)细胞,并使之繁殖和表达的操作。转化子(转化子(transformant)transformant):经转化而带有外源经转化而带有外源DNADNA的受体(宿主)细胞。的受体(宿主)细
11、胞。重组子(重组子(recombinant)recombinant):含有重组含有重组DNADNA的转化子。的转化子。相对于仅含空载体的转化子而言。相对于仅含空载体的转化子而言。1 1、转化的原理与技术、转化的原理与技术CaCa2+2+诱导的完整细菌细胞的转化(诱导的完整细菌细胞的转化(CaCa2+2+法)法)细菌原生质体的转化(原生质体法)细菌原生质体的转化(原生质体法)完整细菌细胞的完整细菌细胞的电穿孔转化(电转化法)电穿孔转化(电转化法)l l噬菌体噬菌体DNADNA的转染的转染1 1)CaCa2+2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌
12、细胞的转化 Ca Ca2+2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌(如诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌等),大肠杆菌等),19701970年建立此技术,其原理是年建立此技术,其原理是CaCa2+2+与细菌外与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构,转化混合物中的膜磷脂在低温下形成液晶结构,转化混合物中的DNADNA与其形成与其形成抗抗DnaseDnase的羟基的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面,后者经热脉冲钙磷酸复合物黏附于细胞表面,后者经热脉冲发生收缩作用,使细胞膜出现空隙,细菌细胞此时的状态即为发生收缩作用,使细胞膜出现空隙,细菌细胞此时的状态即为感受态感受态 。大肠杆菌
13、感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的制备:的制备:100 100 ml ml 菌体培养至菌体培养至ODOD600 600=0.5=0.5,离心收集菌体离心收集菌体 用用10 10 ml ml 冰冷的冰冷的10 10 mMmM CaClCaCl22溶液悬浮菌体,离心溶液悬浮菌体,离心用用1 1 ml ml 冰冷的冰冷的75 75 mMmM CaClCaCl22溶液悬浮菌体溶液悬浮菌体 冰浴放置冰浴放置12-2412-24小时,备用小时,备用 收集菌体收集菌体大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的质粒转化:的质粒转化:取取100 100 m ml l 感受态细胞,加入相当于感受态细胞,加入相当于50 5
14、0 ng ng 载体的重载体的重组组冰浴放置半小时冰浴放置半小时 在在4242保温保温 9090秒秒(热脉冲)(热脉冲)快速将转化细胞转移至冰浴中放置快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-21-2分钟分钟 DNADNA连接液,混匀连接液,混匀加入加入1 1 ml ml 新鲜培养基,新鲜培养基,于于3737培养培养 1 1 小时(扩增)小时(扩增)涂在合适的固体培养基平板上进行筛选涂在合适的固体培养基平板上进行筛选 2 2)细菌原生质体的转化)细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌(如枯草杆菌、链霉菌等)接纳外源革兰氏阳性细菌(如枯草杆菌、链霉菌等)接纳外源DNADNA的主要屏障是细胞壁,因而这类细菌通
15、常采用的主要屏障是细胞壁,因而这类细菌通常采用原生质体原生质体(细胞(细胞去壁后的形态)转化的方法转移质粒或重组去壁后的形态)转化的方法转移质粒或重组DNADNA分子分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化原生质体法进行转化 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同,以链霉菌为例:不同细菌的原生质体制备方法不尽相同,以链霉菌为例:细菌需生长在高渗培养基中(如细菌需生长在高渗培养基中(如34%34%的蔗糖溶液,并加入的蔗糖溶液,并加入甘氨甘氨酸酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中,菌体以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中,菌体应始终悬浮在应
16、始终悬浮在10.3%10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂有器皿应保持无水无去污剂 细菌原生质体细菌原生质体的制备:的制备:取取0.2-10.2-1mlml的原生质体悬浮液(的原生质体悬浮液(10108 88 8-10-109 99 9个原生质体),加个原生质体),加入入10-20 10-20 m ml DNAl DNA重组连接液,同时加入含有重组连接液,同时加入含有PEG1000PEG1000和和CaCa2+2+的等渗溶液,混匀的等渗溶液,混匀 细菌原生质体细菌原生质体的转化:的转化:细菌原生质体细菌原生质体的再生的再生:原
17、生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行,内含脯氨酸和微量元素在特殊的固体培养基上进行,内含脯氨酸和微量元素 3 3)电穿孔转化)电穿孔转化 将将待待转转化化的的质质粒粒或或DNADNA重重组组连连接接液液加加在在电电穿穿孔孔转转化化仪仪的的样样品品池池中中,两两极极施施加加高高压压电电场场。在在强强大大电电场场的的作作用用下下,细细菌菌细细胞胞壁壁和和细胞膜产生缝隙,质粒或细胞膜产生缝隙,质粒或DNADNA重组分子便可进入细胞内重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单,而且几乎对所有含细胞壁结构的受电穿孔转
18、化法操作简单,而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效,但转化效率差别很大体细胞均有效,但转化效率差别很大 同样的原理,电穿孔法也可用于质粒消除实验同样的原理,电穿孔法也可用于质粒消除实验4 4)l l噬菌体噬菌体DNADNA的转染的转染感受态细胞的培养:感受态细胞的培养:将大肠杆菌在含有麦芽糖(不含葡萄糖)和将大肠杆菌在含有麦芽糖(不含葡萄糖)和MgClMgCl22的培养基的培养基 中培养至中培养至ODOD600 600=0.5=0.5吸附:吸附:加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液,加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液,3030保温保温1010分钟分钟转染裂解:转染裂解:加入加入2020倍体
19、积的新鲜培养基,倍体积的新鲜培养基,3030培养培养2 2小时,直至培养液小时,直至培养液 中菌体裂解,培养液澄清度增加,然后涂板筛选中菌体裂解,培养液澄清度增加,然后涂板筛选2 2、转化率、转化率转化率的定义转化率的定义 每微克每微克DNADNA分子转化宿主菌能获得的转化子数。分子转化宿主菌能获得的转化子数。例例如如,pUC18pUC18对对大大肠肠杆杆菌菌的的转转化化率率为为101088,即即每每微微克克pUC18pUC18中中只只有有101088个个分分子子能能进进入入受受体体细细胞胞。一一微微克克pUC18pUC18共共有有3.43.4X10X101111个个分分子子(6.026.02
20、X10X1017 17/2686X6602686X660),也也就就是是说说,每每34003400个个pUC18pUC18分分子子才才有有一一个分子进入受体细胞个分子进入受体细胞 另另一一方方面面,在在实实际际操操作作过过程程中中,转转化化一一微微克克pUC18pUC18共共需需2 2mlml感感受受态态细细胞胞,大大约约含含有有2 2X10X101010个个大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞,也也就就是是说说,每每200200个细胞只有一个细胞能接纳个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNApUC18 DNA 转化率的用途转化率的用途 利用转化率和重组率等参数可以帮助设计利用转化率和重组率等参数可以帮
21、助设计DNADNA重组实验规模重组实验规模例如,例如,某一某一DNADNA重组实验的重组率为重组实验的重组率为20%20%,转化率为,转化率为101077/m mg g载体,载体,经切接处理后的载体转化率比天然的载体低经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100100倍,欲获得倍,欲获得10104 44 4个个 重组克隆,需投入多少载体重组克隆,需投入多少载体DNADNA进行重组实验?进行重组实验?若重组率为若重组率为100%100%,则转化后产生,则转化后产生101044个重组克隆需要:个重组克隆需要:101044/10/1077 X 10 X 10-2-2=0.1 =0.1 m mg g
22、载体载体DNADNA 考虑到实验系统的重组率为考虑到实验系统的重组率为20%20%,所以实际投入载体应为:,所以实际投入载体应为:0.1/20%=0.50.1/20%=0.5 m mg g 载体载体DNADNA 转化率的影响因素转化率的影响因素载体及载体及DNADNA重组分子方面:重组分子方面:载体本身的性质:载体本身的性质:不同的载体转化同一株受体细胞,其转化率不同不同的载体转化同一株受体细胞,其转化率不同 载体的空间构象:载体的空间构象:质粒的超螺旋构象转化率最高,经酶切连接操作后的载质粒的超螺旋构象转化率最高,经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复,其转化率一般要比新制备的体由于空间
23、构象难以恢复,其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级超螺旋质粒低两个数量级 插入片段的大小:插入片段的大小:对质粒载体而言,插入片段越大,转化效率越低对质粒载体而言,插入片段越大,转化效率越低 转化率的影响因素转化率的影响因素受体细胞方面:受体细胞方面:受体细胞必须与载体相匹配,例如:受体细胞必须与载体相匹配,例如:pBR322pBR322转化大转化大肠杆菌肠杆菌JM83JM83株,转化率很低;但对大肠杆菌株,转化率很低;但对大肠杆菌ED8767ED8767株的株的转化率则较高转化率则较高 转化方法方面:转化方法方面:受体细胞的预处理:受体细胞的预处理:影响最大影响最大供受体的比例:供
24、受体的比例:CaCa2+2+诱导转化诱导转化 0.1 0.1 ml ml 感受态感受态细胞细胞 50 50 ng DNAng DNA 转化方法:转化方法:CaCa2+2+诱导转化诱导转化 101066-10-1077/m mg DNAg DNA 原生质体转化原生质体转化 101099 个个原生质体原生质体 50 50 ng DNAng DNA 原生质体转化原生质体转化 101055-10-1066/m mg DNAg DNA l l-DNA-DNA转染转染 101077-10-1088/m mg DNAg DNA 电穿孔转化电穿孔转化 101066-10-1099/m mg DNAg DNA
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 转化与扩增 转化 扩增 PPT 课件
限制150内