第五章基因药物专题.ppt
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1、第五章基因药物专题蔡谨蔡谨,(676417)浙江大学玉泉校区教十5212室Chapter5GeneMedicine(genetherapy)1.概念概念基因:染色体上的基因:染色体上的DNA片段,是遗传信息结构和功能片段,是遗传信息结构和功能 的基本单位。的基本单位。基因基因 决定决定 生老病死生老病死 控制控制 高矮胖瘦高矮胖瘦 影响影响 喜怒哀乐喜怒哀乐基因组:某一生物的细胞中所带有的全部遗传信息。基因组:某一生物的细胞中所带有的全部遗传信息。一一.概述概述基因与疾病基因与疾病基因与人类的疾病密切相关:基因与人类的疾病密切相关:基因与人类的疾病密切相关:基因与人类的疾病密切相关:遗传病是由
2、于基因先天缺陷所致遗传病是由于基因先天缺陷所致遗传病是由于基因先天缺陷所致遗传病是由于基因先天缺陷所致;肿瘤的发生涉及多种基因改变肿瘤的发生涉及多种基因改变肿瘤的发生涉及多种基因改变肿瘤的发生涉及多种基因改变,包括癌基因激活或抑包括癌基因激活或抑包括癌基因激活或抑包括癌基因激活或抑癌基因失活癌基因失活癌基因失活癌基因失活;高血压高血压高血压高血压,糖尿病等多基因病也涉及到多种基因的改变糖尿病等多基因病也涉及到多种基因的改变糖尿病等多基因病也涉及到多种基因的改变糖尿病等多基因病也涉及到多种基因的改变;由病原体所致的传染病也和人体基因密切相关由病原体所致的传染病也和人体基因密切相关由病原体所致的传
3、染病也和人体基因密切相关由病原体所致的传染病也和人体基因密切相关,存在存在存在存在易感人群和耐受人群易感人群和耐受人群易感人群和耐受人群易感人群和耐受人群.基因药物:将具有治疗作用的基因重组进真核表达载体,直接转移到人体细胞,表达出具有治疗作用的蛋白质和多肽,从而达到治疗作用的新方法。TheapplicationofgeneticprinciplesinthetreatmentofhumanTheapplicationofgeneticprinciplesinthetreatmentofhumandiseasedisease ByintroductionofgeneticByintroduct
4、ionofgenetic materialintotargetcellsinordertomaterialintotargetcellsinordertocounteracttheeffectofadiseasegeneorintroduceanewfunctioncounteracttheeffectofadiseasegeneorintroduceanewfunction“Youmayneverhavetopurifyaprotein,ormanufactureadrug,youjusthavetomakethevectorandgetintothepatient.Whybothermar
5、ketingit?Youcanjustletthecelldoit.”Prof.JumWilsome,美国基因治疗中心主任基因治疗的必要条件基因治疗的必要条件UnderstandingofthediseaseprocessStructure/functionofgenetobeintroducedEfficientdeliveryofgenecontrolofgeneexpressionPrevention/controlofimmuneresponsesAnimalmodelandassessmentoffunctionClinicaltrial研究基因治疗的三个基本步骤研究基因治疗的三个基
6、本步骤寻找适当的靶细胞寻找适当的靶细胞导入目的基因导入目的基因基因表达基因表达分类生殖细胞基因治疗(germlinegenetherapy)生殖细胞或早期胚胎细胞体细胞基因治疗(somatic-cellgenetherapy)体细胞体细胞基因治疗始终需要考虑的问题体细胞基因治疗始终需要考虑的问题基因转移的效率基因转移的效率治疗的特异性治疗的特异性基因表达的持久性及其调节基因表达的持久性及其调节治疗的毒副作用治疗的毒副作用什么疾病什么疾病什么基因什么基因什么载体什么载体什么靶器官和靶细胞什么靶器官和靶细胞什么基因导入方法什么基因导入方法二、基因治疗和传统的基因工程的区别二、基因治疗和传统的基因工
7、程的区别二者都着眼于寻找可治病或有其他应用价值的二者都着眼于寻找可治病或有其他应用价值的“目的基因目的基因”。基因工程:基因工程:目的基因目的基因载体载体导入大肠杆导入大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞菌、酵母和哺乳动物细胞体外表达所需要的蛋体外表达所需要的蛋白白经过分离纯化获得能用于治疗或其他用途的经过分离纯化获得能用于治疗或其他用途的蛋白纯品蛋白纯品,最终是制造出一种蛋白类的药物。最终是制造出一种蛋白类的药物。基因治疗基因治疗目的基因目的基因载体载体导入导入人体,目的基因在人体内的细胞中制造所需要人体,目的基因在人体内的细胞中制造所需要的蛋白的蛋白达到治病的目的。达到治病的目的。基因治疗在技术上
8、一旦成功基因治疗在技术上一旦成功,其优势:其优势:制品为基因及其载体,非基因表达蛋白制品为基因及其载体,非基因表达蛋白产物产物,不需复杂的蛋白产物分离和纯化工艺不需复杂的蛋白产物分离和纯化工艺生产成本远远低于基因工程产品生产成本远远低于基因工程产品从理论上讲从理论上讲,凡能治病的基因,都有可能开发凡能治病的基因,都有可能开发成为成为“药物药物”半衰期半衰期多肽药物多肽药物基因药物基因药物产物产物多肽蛋白质多肽蛋白质基因基因载体载体无信号肽无信号肽有信号肽有信号肽宿主细胞宿主细胞大肠杆菌大肠杆菌酵母等酵母等人体细胞(体内)人体细胞(体内)转染转染容易容易难难生产工艺生产工艺复杂复杂较简单较简单纯
9、化纯化复杂复杂较简单较简单成本成本高高较经济较经济稳定性稳定性低低高高保存保存难难易易半衰期半衰期短短长长用法用法长期注射长期注射一次性注射一次性注射副作用副作用高高低低但基因治疗难度高,技术要求极为苛刻。例但基因治疗难度高,技术要求极为苛刻。例如,针对各种疾病,必须具有能够达到治病目的的如,针对各种疾病,必须具有能够达到治病目的的基因。在此基础上,还必须具有能有效地将基因导基因。在此基础上,还必须具有能有效地将基因导入人体的载体系统,这种系统要求高效,而且能定入人体的载体系统,这种系统要求高效,而且能定向地导入人体某种细胞。基因导入人体后,必须能向地导入人体某种细胞。基因导入人体后,必须能够
10、控制它的表达。够控制它的表达。因此,基因治疗是生物高技术的高度集成,因此,基因治疗是生物高技术的高度集成,是遗传学、分子生物学、细胞生物学、分子病毒是遗传学、分子生物学、细胞生物学、分子病毒学等多种学科知识和技术的高度综合。学等多种学科知识和技术的高度综合。三、基因治疗的主要策略三、基因治疗的主要策略GenereplacementGeneaugmentationtherapy(GAT)Genecorrection(Chimeraplasty)TargetedkillingofspecificcellsTargetedinhibitionofgeneexpression(Geneablation
11、)Genereplacement:DeficientgenecorrectedbyreplacingthemutatedDeficientgenecorrectedbyreplacingthemutatedallelewithanintactallele;usedforthetreatmentofallelewithanintactallele;usedforthetreatmentofautosomaldominantdisorders.autosomaldominantdisorders.Thestrategiesareasfollows:Thestrategiesareasfollows
12、:a)kockoutmutationbysinglecrossing-overa)kockoutmutationbysinglecrossing-over(insertionalinactivation)(insertionalinactivation)b)genereplacementbydouble(reciprocal)crossing-b)genereplacementbydouble(reciprocal)crossing-overoverc)targetgeneinhibitionindominantnegativegeneticc)targetgeneinhibitionindo
13、minantnegativegeneticdisorders;usuallymutatedproteinswhichinteractdisorders;usuallymutatedproteinswhichinteractwithnormalcellularproteinstocreatealteredwithnormalcellularproteinstocreatealteredproperties;mutationalinactivationoftheonemutatedproperties;mutationalinactivationoftheonemutatedcopywillall
14、eviatethismutantphenotype;thecopywillalleviatethismutantphenotype;themutationcanbecarriedoutbyinsertionalinactivation,mutationcanbecarriedoutbyinsertionalinactivation,orantisensetechnology.orantisensetechnology.GeneAugmentationTherapy(GAT)Fordiseasescausedbylossofgenefunctionmorecopiesofnormalgenera
15、iselevelsofgeneproductrestorenormalphenotypeApplyto:monogenicrecessivediseasescysticfibrosis,haemophilia,musculardystrophyGeneCorrection-Chimeraplastytumour celltkthymidinekinasegeneviralvectorganciclovirganciclovirphosphateTargetedKillingGeneticPro-drugActivationTherapyTargetedinhibitionofgeneexpre
16、ssionRibozymes-cancleave(orrepair)mRNATriplehelixoligonucleotides-blockgenetranscriptionAntisenseoligos-blockmRNAtranslationAll gene therapy strategies dependon getting the gene or genetic material into the target cells!治疗方式治疗方式矫正性基因治疗矫正性基因治疗基因置换(genereplacement)基因矫正(genecorrection)基因增强(geneaugmenta
17、tion)调控性基因治疗调控性基因治疗调控基因的表达来达到改善疾病的目的(1)反义技术A)反义基因到载体,耙细胞到反义RNA,封闭mRNA的翻译B)合成反义寡聚脱氧核苷酸,化学修饰导入体内,胞吞与DNA结合形成核苷酸三聚体,与转录因子结合,转录不能启动;或与mRNA结合形成RNA-DNA杂链,影响基因的表达。C)核酶)核酶具有催化作用的RNA分子,能催化切割降解异常表达基因的RNA分子,已经设计出特殊的核酶。(2)通过其他基因的代偿作用弥补缺陷基因的功能。四.基因转移体系若干相关术语:若干相关术语:Transfection转染转染:过去:将病毒过去:将病毒DNA或或RNA转入细胞。转入细胞。现
18、在:将外源现在:将外源DNA转入动物细胞。转入动物细胞。DNATransfer转移:基因导入或转移广义的概念。转移:基因导入或转移广义的概念。Transduction转导:噬菌体介导的细菌之间的基转导:噬菌体介导的细菌之间的基因因转移。转移。Transformation转化:将裸转化:将裸DNA或质粒导入原核或质粒导入原核和真核细胞。和真核细胞。转移途径1)exvivo法,体外途径体外途径。体外基因导入人体细胞,再将细胞植入人体。经典,安全,效果较易控制,对基因转移效率要求不高,但步骤多,复杂,难度大。2)invivo法,体内途径体内途径。将含治疗基因的重组载体直接植入体内。操作简单,容易推广
19、,但对基因转移技术要求高。a a aaa aEx-vivoIn-vivotopicaldeliveryIn-vivosystemicdeliveryVExamples:-bonemarrow-livercells-skincellsExamples:-brain-muscle-eye-joints-tumorsExamples:-Intravenous-intra-arterial-intra-peritonealTHREEclassesofanatomicalgenedelivery基因治疗过程中的基因转移方法基因治疗过程中的基因转移方法Viral vectorsNon-viral vect
20、orsPhysical methods目前最有效的是病毒载体,但存在目前最有效的是病毒载体,但存在插入大小有限、免疫原性强和生产插入大小有限、免疫原性强和生产难等局限难等局限1、病毒载体类型、病毒载体类型反转录病毒(反转录病毒(RV)载体)载体retrovirus腺病毒(腺病毒(AV)载体载体adenovirus 腺相关病毒(腺相关病毒(AAV)载体载体Adeno-associatedvirus单纯疱疹病毒(单纯疱疹病毒(HSV)载体载体herpessimplexvirus 慢病毒(慢病毒(lentivirus)载体等载体等对载体的基本要求:对载体的基本要求:特异并有效的基因转移特异并有效的基
21、因转移特异、高效、持续性表达,具有可控性特异、高效、持续性表达,具有可控性免疫原性低免疫原性低易于生产易于生产载体特征载体特征:reproducibility stablepropagatedpurifiedtohightitersmediatedtargeteddelivery基因治疗病毒载体比较基因治疗病毒载体比较 RV AV AAV HSV LVRV AV AAV HSV LV基因组成基因组成 ssRNA dsDNA ssDNA dsDNA dsRNA ssRNA dsDNA ssDNA dsDNA dsRNA基因组长度基因组长度 10kb 36kb 5kb 152kb 10kb 10k
22、b 36kb 5kb 152kb 10kb装载容量装载容量 8kb 8kb 4.5kb 30kb 9kb 8kb 8kb 4.5kb 30kb 9kb病毒滴度病毒滴度 10 107 7 10 101111 10 108 8 10108 8 10108 8感染细胞谱感染细胞谱 窄窄 宽宽 宽宽 窄窄 宽宽感染能力感染能力 中中 很强很强 强强 强强 中中整合能力整合能力 有有 无无 有有 无无 强强毒性作用毒性作用 遗传毒遗传毒 细胞毒细胞毒 遗传毒遗传毒 细胞毒细胞毒 遗传毒遗传毒免疫原性免疫原性 弱弱 中等中等 弱弱 强强 弱弱病病毒毒型型载载体体逆转录逆转录病毒病毒腺病毒腺病毒疱疹病毒疱疹
23、病毒腺相关腺相关病毒病毒慢病毒慢病毒优点优点:安全,对人体低病原性安全,对人体低病原性针对增殖的细胞针对增殖的细胞长期稳定表达长期稳定表达外源基因插入能力适中。外源基因插入能力适中。缺点缺点:导入率低导入率低随机整合到宿主细胞,有插随机整合到宿主细胞,有插入性基因突变或癌变的危险入性基因突变或癌变的危险无导向性。无导向性。优点优点:高效导入、高滴度高效导入、高滴度非增殖细胞也能非增殖细胞也能导入,对遗传、代谢病有利导入,对遗传、代谢病有利基因插入能基因插入能力强(力强(30kb30kb)宿主广泛宿主广泛缺点缺点:有严重的免疫反应。有严重的免疫反应。无导向性无导向性优点优点:无细胞毒性,无免疫反
24、应无细胞毒性,无免疫反应 转导稳定,转导稳定,长期表达长期表达具有在特定位点整合的潜力,导具有在特定位点整合的潜力,导入基因后可特殊表达入基因后可特殊表达个体小,可广泛分布。个体小,可广泛分布。缺点缺点:可做到高滴度可做到高滴度,但包装困难但包装困难有随机整合有随机整合的可能的可能基因插入量有限(基因插入量有限(5kb5kb)优点优点:有嗜神经性,可用于神经系统疾病有嗜神经性,可用于神经系统疾病有环有环状分子形式的潜伏状态状分子形式的潜伏状态基因插入容量大。基因插入容量大。缺点缺点:细胞毒性和免疫原性不细胞毒性和免疫原性不 定定潜伏期潜伏期HSV-1HSV-1可能回复突变为野生型可能回复突变为
25、野生型,导致脑炎或死亡导致脑炎或死亡优点优点:能转导神经细胞能转导神经细胞中等插入量。中等插入量。缺点缺点:随机整合随机整合可能回复突变为野生型可能回复突变为野生型。retrovirusadenovirusHSVAAVlentivirus反转录病毒载体基因转移系统反转录病毒载体基因转移系统辅助细胞辅助细胞:将含有病毒结构基因但缺将含有病毒结构基因但缺失了顺式包装信号的缺陷型反转录病失了顺式包装信号的缺陷型反转录病毒导入哺乳动物细胞(毒导入哺乳动物细胞(2 2,PA317PA317,CRIPCRIP)。可产生病毒包装蛋白但。可产生病毒包装蛋白但不产生病毒颗粒;不产生病毒颗粒;反转录病毒载体反转录
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- 第五 基因 药物 专题
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