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1、关于实验体外重组现在学习的是第1页,共25页实验目的与要求实验目的与要求掌握体外掌握体外DNA的重组过程;的重组过程;学习外源学习外源DNA分子经限制性内切酶切分子经限制性内切酶切割后与载体的连接及转化过程;割后与载体的连接及转化过程;学习对学习对DNA重组子的筛选方法。重组子的筛选方法。现在学习的是第2页,共25页实验原理实验原理实验材料实验材料实验步骤实验步骤预期结果预期结果注意事项注意事项现在学习的是第3页,共25页一、实验原理一、实验原理1、DNA重组简介重组简介2、DNA连接酶连接酶3、TA克隆克隆4、蓝白筛选、蓝白筛选现在学习的是第4页,共25页DNA重组是外源重组是外源DNA与载
2、体分子的连与载体分子的连接,重组的接,重组的DNA分子是在分子是在DNA连接酶连接酶的作用下,有的作用下,有Mg2、ATP存在的连存在的连接缓冲系统中,将经过酶切的或脱接缓冲系统中,将经过酶切的或脱磷酸处理的载体分子与外源磷酸处理的载体分子与外源DNA分分子进行连接。这样经过重新组合的子进行连接。这样经过重新组合的DNA叫做重组体或重组子。叫做重组体或重组子。1、DNA重组简介重组简介现在学习的是第5页,共25页DNA重组包括如下步骤:重组包括如下步骤:外源外源DNA片段的制备;片段的制备;载体的选择;载体的选择;DNA片段与载体连接;片段与载体连接;导入宿主细胞。导入宿主细胞。现在学习的是第
3、6页,共25页现在学习的是第7页,共25页现在学习的是第8页,共25页 2种种连连接接酶酶T4噬噬菌菌体体DNA连连接接酶和大肠杆菌酶和大肠杆菌DNA连接酶连接酶。(1)大肠杆菌)大肠杆菌DNA连接酶连接酶 仅仅能能连连接接具具有有相相同同粘粘性性末末端端的的两两个个DNA分子。分子。2、DNA连接酶连接酶现在学习的是第9页,共25页(2)T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶 不不仅仅能能连连接接具具有有相相同同粘粘性性末末端端的的两两个个DNA分分子子,还还可可以以连连接接平平末末端端双链双链DNA分子。分子。但但后后者者连连接接效效率率比比较较低低,一一般般可可提提高高T酶酶浓浓度度或或增增
4、加加DNA浓浓度度来来提提高高平平末端的连接效率。末端的连接效率。现在学习的是第10页,共25页2、DNA连接酶连接酶 T4噬菌体噬菌体DNA连接酶催化连接酶催化DNA连接反应分为连接反应分为3步:步:首先,首先,T4连接酶与辅助因子连接酶与辅助因子AMP形成酶形成酶-AMP复合物;复合物;然后,酶然后,酶-AMP复合物再结合到具有复合物再结合到具有5-磷酸基磷酸基和和3-羟基切口的羟基切口的DNA上,使上,使DNA腺苷化;腺苷化;最后,产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。最后,产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。酶最适温度为酶最适温度为37,但该温度下粘性末端氢键,但该温度下粘性末端氢键
5、不稳定,所以连接反应一般采取不稳定,所以连接反应一般采取1216 连接连接过夜。过夜。现在学习的是第11页,共25页磷酸二酯键的形成DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接现在学习的是第12页,共25页3、TA克隆克隆将将33端端具具有有单单个个“A A”突突出出末末端端的的PCRPCR产产物物克克隆隆到到33端端具具有有单单个个“T T”突突出出末末端端的的线性化载体的克隆法。线性化载体的克隆法。现在学习的是第13页,共25页现在学习的是第14页,共25页4、蓝白筛选蓝白筛选pUC质质粒粒载载体体含含有有大大肠肠杆杆
6、菌菌-半半乳乳糖糖苷苷酶酶基基因因(lac z)的的启启动动子子(受受IPTG诱诱导导)及及其其编编码码肽肽链链(-半半乳乳糖糖苷苷酶酶的的氨氨基基末末端端短短片片段段)的的DNA序序列列(特特称称为为lac z基基因因)。位位于于 lac z基基因因 中中 靠靠 近近 5端端 有有 一一 段段 多多 克克 隆隆 位位 点点(MCS)区区段段,但但它它并并不不破破坏坏该该基基因因的功能。的功能。现在学习的是第15页,共25页受体大肠杆菌细胞受体大肠杆菌细胞的的-半乳糖苷酶发半乳糖苷酶发生了突变,失去的氨基末端。生了突变,失去的氨基末端。当当lacz基因编码的基因编码的肽链同失去了正肽链同失去了
7、正常氨基末端的常氨基末端的-半乳糖苷酶突变体互半乳糖苷酶突变体互补时,便会产生出有活性的补时,便会产生出有活性的-半乳半乳糖苷酶分子,在糖苷酶分子,在IPTG诱导下,会启诱导下,会启动表达,分解动表达,分解X-gal产生蓝色背景。产生蓝色背景。现在学习的是第16页,共25页当当MCS中插入外源基因后,中插入外源基因后,会阻断会阻断肽链合成,不能形成互补,不能肽链合成,不能形成互补,不能产生功能活性的产生功能活性的-半乳糖苷酶,也半乳糖苷酶,也就不会产生蓝色背景。就不会产生蓝色背景。所以含有重组质粒载体的克隆是白所以含有重组质粒载体的克隆是白色的。色的。现在学习的是第17页,共25页二、实验材料
8、二、实验材料l、仪器和材料、仪器和材料 感感受受态态细细胞胞(如如E.coli JMl09、DH5 a)恒恒温温培培养养箱箱,恒恒温温摇摇床床,恒恒温温水水浴浴槽槽,1.5 mL微微量量离离心心管管(Ep管管),微微量量取取液液器器200 L及及20 L吸吸头头,电电泳泳仪仪,电泳槽。电泳槽。现在学习的是第18页,共25页 2、试剂、试剂 (1)载体:质粒载体:质粒pUC l8/19 (2)目的基因:如小牛胸腺目的基因:如小牛胸腺DNA (3)限制性内切酶:限制性内切酶:EcoRI,Hind (4)T4 DNA连接酶连接酶 (5)0.1 mol/L CaCl2溶液溶液 (6)LB琼脂固体平板琼
9、脂固体平板(含氨苄青霉素)(含氨苄青霉素)(7)5 mL LB液体培养基(含氨苄青霉素)液体培养基(含氨苄青霉素)(8)20 mg/mL X-gal(5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷)半乳糖苷)(9)200 mg/mL IPTG(异丙基硫代(异丙基硫代-D-半半乳糖苷)乳糖苷)(10)琼脂糖琼脂糖 (11)无菌双蒸水无菌双蒸水现在学习的是第19页,共25页三、实验步骤三、实验步骤1、双酶切目的基因及载体(、双酶切目的基因及载体(TA克隆克隆法可省此步)法可省此步)2、连接与转化、连接与转化3、培养观察、培养观察现在学习的是第20页,共25页1、连接(、连接(5L 体系):体系):
10、pEASY T3 1L PCR纯化产物纯化产物 1-4L(Taq酶扩增)酶扩增)25 连接连接15min。一般,载体一般,载体:外源基因(摩尔比)外源基因(摩尔比)=1:21:102、转转化化:10L连连接接产产物物全全用用来来转转化化200L大大肠肠杆杆菌菌感感受受态态细细胞胞。在在含含Amp的的LB平平板板上上,添添加加40 L 20 mg/mL X-gal及及4 L 200 mg/mL IPTG,然然后后涂涂布布转转化后的细胞。化后的细胞。3、培培养养:37,倒倒置置培培养养16h后后,观观察察结结果果。计计数数白色和蓝色菌落。白色和蓝色菌落。现在学习的是第21页,共25页四、预期实验结
11、果四、预期实验结果37倒置培养倒置培养1216 h后,平板上可见生长有蓝色和后,平板上可见生长有蓝色和白色的菌落,其中白色菌落含有重组白色的菌落,其中白色菌落含有重组DNA,蓝色菌落,蓝色菌落含有未重组成功的质粒含有未重组成功的质粒DNA 现在学习的是第22页,共25页五、注意事项五、注意事项双酶切时,注意选择合适高效的双酶切时,注意选择合适高效的2种酶,注意双酶的缓冲液、温度的协种酶,注意双酶的缓冲液、温度的协调。调。酶的加入量须小于反应体积的酶的加入量须小于反应体积的1/10,否则酶液中所含有甘油会抑制,否则酶液中所含有甘油会抑制酶解反应。酶解反应。注意连接体系中,载体与插入片段之间的注意连接体系中,载体与插入片段之间的 摩尔比。摩尔比。插入片段所需量(插入片段所需量(ng)=载体含量(载体含量(ng)*插入片段长度插入片段长度(kb)载体长度载体长度(kb)*片段与载体摩尔比片段与载体摩尔比现在学习的是第23页,共25页时间安排时间安排8:309:30 讲课讲课9:3011:30 连连接接,连连接接过过程程中中倒倒固固体体LB平平板板,清清点点器器皿皿,清洗后归还,吃午饭清洗后归还,吃午饭12:00以后以后 连接连接第二天第二天 观察结果观察结果现在学习的是第24页,共25页感谢大家观看现在学习的是第25页,共25页
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