荧光显微镜的基本原理及应用精选PPT.ppt
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1、关于荧光显微镜的基本原理及应用第1页,讲稿共20张,创作于星期三第2页,讲稿共20张,创作于星期三一、一、荧光显微镜荧光显微镜(fluorescence microscope)原理:原理:某些物质经一定波长的光(如紫外光)照射后,物质某些物质经一定波长的光(如紫外光)照射后,物质中的分子被激活,吸收能量后跃迁至激发态;当其从激发态返回到中的分子被激活,吸收能量后跃迁至激发态;当其从激发态返回到基态时,所吸收的能量除部分转化为热量或用于光化学反应外,其基态时,所吸收的能量除部分转化为热量或用于光化学反应外,其余较大部分则以光能形式辐射出来,由于能量没能全以光的形式辐余较大部分则以光能形式辐射出来
2、,由于能量没能全以光的形式辐射出来,故所辐射出的光的波长比激发光的要长,这种波长长于激射出来,故所辐射出的光的波长比激发光的要长,这种波长长于激发光的可见光部就是荧光发光的可见光部就是荧光(fluorescence)。所谓荧光就是某些物质。所谓荧光就是某些物质在一定波长光(如紫外光)的照射下、在极短时间内所发出的比照在一定波长光(如紫外光)的照射下、在极短时间内所发出的比照射光波长更长的可见光。射光波长更长的可见光。第3页,讲稿共20张,创作于星期三第4页,讲稿共20张,创作于星期三第5页,讲稿共20张,创作于星期三二、荧光显微镜的组成二、荧光显微镜的组成1、光源:一般采用高压汞灯2、滤色系统
3、:由激发滤板和压制滤板组成a、激发滤板:提供一定范围的激发光b、压制滤板:完全阻挡激发光通过,提供相应滤长范围荧光3、反光镜:一般采用平面反光镜4、聚光镜:用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成5、物镜和目镜第6页,讲稿共20张,创作于星期三The optical system of a fluorescence microscope.A filter set consists of two barrier filters(1 and 3)and a dichroic mirror(beam-splitting 2)第7页,讲稿共20张,创作于星期三第8页,讲稿共20张,创作于星期三三、荧光显微镜
4、的操作 (1)安装紫外防护罩。(2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。(3)插入挡光板,中断光路。(4)预热510分钟。(5)将载有样品的载玻片放到载物台上。(6)选择接物镜(按照先低倍,后高倍顺序)。第9页,讲稿共20张,创作于星期三 (7)旋转分光镜组件转盘,选择所需要的分光镜组件:“O”为观察透射光时用;“WU”为观察蓝色荧光时用(如DAPl);“WB”为观察绿色荧光时用(如FITC);“WG为观察红色荧光时用(如TRITC)。(8)使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内置于荧光显微镜)。(9)通过粗、细螺旋调整焦距。(10)打开与显微镜连接的计算机,点击数码成像系统软件,采集数码图像。第10页,
5、讲稿共20张,创作于星期三四、荧光显微镜标本制作要求(一)载玻片载玻片厚度应在0.81.2mm之间,太厚的坡片,一方面光吸收多,另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁,厚度均匀,无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。(二)盖玻片盖玻片厚度在0.17mm左右,光洁。为了加强激发光,也可用干涉盖玻片,这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)的盖玻片,它可以使荧光顺利通过,而反射激发光,这种反射的激发光女可激发标本。第11页,讲稿共20张,创作于星期三(三)标本组织切片或其他标本不能太厚,如太厚激发光大部分消耗在标本下部,而物镜直接观察到的上部不充分激发
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