2018-2019学年高二生物北师大版选修1导学练课件:第4章 现代生物技术 4.3 聚合酶链式反应技术.ppt
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1、第3节聚合酶链式反应技术,1.记住PCR技术的原理。2.简述PCR技术的基本操作。3.说出PCR技术的应用。,一,二,三,一、DNA片段的扩增1.概念PCR技术是体外酶促合成特定DNA片段的一种方法。2.扩增条件按照DNA复制所需条件,在体外酶促合成DNA时,必须具备待扩增的目的DNA(DNA合成的模板)、合成DNA时所需的特异引物和原料4种三磷酸脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、起酶促作用的耐热Taq DNA聚合酶和作为反应介质的缓冲溶液。,四,一,二,三,3.原理根据DNA的理化特性,在高温条件下,双链DNA解旋变为单链DNA(变性);低温条件下单链DNA又可恢复为双链
2、DNA(复性);中温条件下能进行DNA合成,使DNA链延伸。由此,PCR反应过程一般采取“高温变性低温复性中温延伸”三个步骤,促使DNA进行复制。以上述反应作为一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,得到大量的目的DNA片段。,四,一,二,三,四,二、琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便的快速分离、纯化和鉴定DNA的方法。琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔,带有大量负电荷的DNA分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向正极泳动。DNA片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分子的大小,因此 大小一致的DNA分子会在凝胶的一定位置形成DNA条带。,一,二,三,四,三、DNA片段的扩增和琼
3、脂糖凝胶电泳的方法步骤1.DNA片段的PCR扩增(1)把PCR反应体系的各种药品加入冰浴的EP管中,混合均匀后 低速离心。每管加入30 L无菌石蜡油。(2)将EP管放入PCR热循环仪中,输入并运行反应程序。2.扩增产物的检测制作电泳胶板加样电泳观察。,一,二,三,四,四、PCR影响因素在PCR实验中,需要扩增的DNA片段的大小决定延伸的时间,片段较大,中温延伸的时间就要相应延长;引物的碱基数量和组成则决定着复性温度的选择,如果引物越短,A、T含量越多,PCR反应的复性温度就越低,反之引物长度较长,G、C含量较高,则需要设计较高的复性温度。Taq DNA聚合酶在PCR扩增过程中也存在大约为110
4、-5的出错概率,而且随着循环数的增加,其活性也逐渐降低。因此,PCR扩增循环次数并非越多越好,一般控制在2535个循环。,一,二,三,四,思考:2014年埃博拉疫情在非洲蔓延,随后生物科学研究工作者迅速研制出了埃博拉病毒检测试剂盒,使得能够快速诊断出埃博拉患者。那么,埃博拉病毒检测试剂盒所需的大量埃博拉病毒基因是怎样获得的呢?提示:采用PCR技术对埃博拉病毒的基因迅速扩增产生的。,1.PCR技术与DNA的复制PCR反应通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR反应的实质就是DNA复制,所以PCR反应与DNA复制的原理相同,计算方法也大体相同。例如:PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累
5、,其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段。,2.PCR的常见问题PCR实验很容易出现假阳性(检测出非目的片段的扩增,而未检测出目的片段的扩增)或假阴性(未检测出任何片段的扩增)的结果。PCR技术高度灵敏,极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增,因此模板DNA的污染是PCR出现假阳性结果的主要原因。此外,样品中存在靶基因的类似序列也可能造成假阳性结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果,PCR操作时要注意做到隔离操作区,分装试剂,简化操作程序,使用一次性吸头等。,出现假阴性结果的常见原因有Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制;引物
6、设计不合理;提取的模板质量或数量不过关、PCR系统的建立欠妥当及循环次数不够,等等。当实验中出现假阴性的情况时,应首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶,并增加510次循环。为了防止假阴性结果的出现,在选用Taq DNA聚合酶时,要注意用活力高、质量好的酶。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度的要求不高,但也不允许有机试剂的污染。所以,在提取DNA模板时,应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物。PCR扩增的先决条件以及特异性的高低,很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况,尤其需要保证引物的3端与靶基因互补。,PCR的原理及应用【例题1】 下列有关PCR的描述,不正确的是()A.
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