间充质干细胞的传代优秀PPT.ppt
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1、试验四试验四 间充质干细胞间充质干细胞的培育及鉴定的培育及鉴定 一、试验目的一、试验目的 n1、驾驭大鼠骨髓间充质干细胞原代培育的方法。n2、娴熟驾驭间充质干细胞的传代、冻存和复苏的操作过程。n3、驾驭间充质干细胞表面抗原的鉴定方法。n4、通过诱导间充质干细胞成脂、成骨分化,鉴定间充质干细胞的多向分化潜能,并驾驭其诱导分化的方法。二、试验材料、试剂与器材二、试验材料、试剂与器材 n1 材料:100-150 g SD大鼠。n2 试剂:乙醚,75%酒精,L-DMEM 低糖培育基,胎牛血清,小牛血清,Percoll细胞分别液,1.5M NaCl溶液,0.25%胰酶,FITC标记的羊抗鼠CD29抗体,
2、FITC标记的羊抗鼠CD90抗体,FITC标记的羊抗鼠CD71抗体,PE标记的羊抗鼠CD106抗体,FITC标记的羊抗CD45抗体,-甘油磷酸钠,地塞米松,维生素C,Hoechst33258,油红O,20 g/L硝酸钴溶液,20 g/L硫化铵,50%甘油,多聚赖氨酸(PLL)。n3 仪器:n细胞培育箱,微量移液器,倒置相差显微镜,细胞培育皿,荧光显微镜,电子天平,pH计,离心机,超净工作台,电热恒温鼓风干燥箱,电热恒温水槽,超声波清洗机,立式压力蒸汽灭菌器。三、试验原理三、试验原理 间充质干细胞最早发觉于骨髓中,其具有高度增殖和自我更新实力,但骨髓中MSCs的含量很低,约为0.01%。分别间充
3、质干细胞的方法主要有三种:全骨髓贴壁培育法;密度梯度离心法;依据间充质干细胞的表面标记,利用流式细胞仪进行分选。在本试验中所用的是密度梯度离心法,即利用Percoll将大部分造血细胞和单个核细胞分别、经过体外贴壁培育换液去除悬浮生长的造血干细胞、分别获得MSC的纯度达到90%左右。间充质干细胞没有特异性表面抗原,表达CD29、CD44、CD71、CD90等基质细胞和间质细胞的特异性表面标记抗原。本试验选择了CD29、CD44、CD90、CD71、CD106和CD45进行检测。n 间充质干细胞连续传代培育和冷冻保存后仍具有多向分化实力,而且可保持正常的核型和端粒酶活性,但并不能自发分化,在体外特
4、定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞,脂肪细胞等多种中胚层来源的细胞,不仅如此,它还可跨胚层分化为神经元细胞,胰岛细胞等。(一)骨髓间充质干细胞的原代培育(一)骨髓间充质干细胞的原代培育 1.取体重100-150 g的大鼠,乙醚麻醉,颈椎脱臼处死,75%的酒精浸泡消毒5 min。2.将大鼠腹部朝上,四肢用注射器针头固定于泡沫板,呈“大”字形,用剪刀,镊子将两后肢皮肤剪开,换另一套剪刀、镊子分别肌肉、肌腱,将股骨、胫骨剥离出来,放入装有75%酒精的烧杯中,移入超净台。3.将胫骨、股骨取出放入培育皿中加入10 ml PBS缓冲液,用干净的剪刀、镊子进一步剥离骨头上的肌肉、肌腱组织。4.将剥离干净的骨
5、头用少量PBS冲洗后,放入另一培育皿,加入12 ml DMEM完全培育基,在培育基中剪断骨干两端,用2 ml注射器吸取培育基插入一头断端将骨髓从另一头冲出,反复吹打使骨髓分散,制成匀整的细胞悬液。5.另取一干净离心管A,加入10 ml Percoll分别液。将吹打匀整的细胞悬液沿倾斜30o缓缓加入,切记不能冲破Percoll分别液面,用8 ml DMEM完全培育基冲洗培育皿,后用同样的方法将其加入离心管A。6.25003000 r/min,离心30 min后,可见离心管A中液体基本分三层,用吸管吸去上层红色培育基层,将吸管伸至中间白色絮状层将其缓慢吸出,移至另一干净离心管B,切记吸取时不行用力
6、过猛而将沉于管底的红细胞吸上来。7.将20 ml PBS加入离心管B,反复吹打混匀,1800 r/min离心10 min。8.弃上清,重复步骤7。9.弃上清,加入5 ml完全培育基,吹打混匀,接种于培育瓶中。【试验结果与分析】【试验结果与分析】每每天天留留意意视视察察培培育育的的原原代代细细胞胞的的形形态态,并拍照记录。并拍照记录。【思索题【思索题】1、密度梯度离心法的原理是什么?、密度梯度离心法的原理是什么?2、间间充充质质干干细细胞胞的的原原代代培培育育过过程程是是什什么么,有有哪哪些些方方面是须要留意的?面是须要留意的?(二二)间充质干细胞的传代、冻存及复苏间充质干细胞的传代、冻存及复苏
7、 1.当细胞融合度达到90%左右时,将培育液吸出,加入PBS冲洗细胞两次。2.加入0.25%的胰酶2 ml,置于37培育箱中23 min,取出在显微镜下视察,当8090%的细胞回缩成圆形,振摇后脱离瓶底时,移入超净台。3.传代:加入3 ml DMEM完全培育基终止消化,用吸管反复吹打瓶底,将细胞悬液移入离心管中,1200 r/min,离心10 min。弃上清,加入10 ml培育基吹打混匀。接种于两个培育瓶中。4.冻存:加入3 ml DMEM完全培育基终止消化,用吸管反复吹打瓶底,将细胞悬液移入离心管中,1200 r/min,离心10 min。弃上清,加入1 ml冻存液(FCS:DMSO:L-D
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