基因克隆质粒载体.ppt
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1、关于基因克隆的质粒载体第一张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月一、基因工程四大要素:一、基因工程四大要素:目的基因目的基因克隆载体克隆载体工具酶工具酶受体系统受体系统第二张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月 单独的基因不易进入细胞单独的基因不易进入细胞 进入后不能维持进入后不能维持.三、什么是克隆载体?三、什么是克隆载体?vector通过不同途径能将承载的外源通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受体片段带入受体细胞,并在其中得以维持的细胞,并在其中得以维持的DNA分子称为分子称为DNA克克隆载体或基因克隆载体。隆载体或基因克隆载体。二、为什么要用克隆载体?二、为什么要用
2、克隆载体?第三张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月载体具有如下功能载体具有如下功能:1.1.运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞2.2.为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力3.3.为外源基因的扩增或表达提供条件为外源基因的扩增或表达提供条件 第四张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月四、作为克隆载体的四、作为克隆载体的DNA分子必须具备主要条件:分子必须具备主要条件:1.1.有有1 1至多个克隆位点,供外源至多个克隆位点,供外源DNADNA片段组入克隆载体片段组入克隆载体DNADNA分子。分子。2.2.能自我复制,或整合到染色体
3、能自我复制,或整合到染色体DNADNA上随染色体上随染色体DNADNA的复制而同步复制。的复制而同步复制。3.3.必须具有用于选择克隆子的标记基因。必须具有用于选择克隆子的标记基因。4.4.必须是安全的。必须是安全的。第五张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月五、克隆载体的种类五、克隆载体的种类根据来源可分为:根据来源可分为:质粒载体质粒载体 病毒或噬菌体载体病毒或噬菌体载体 质粒质粒DNA与病毒或噬菌体与病毒或噬菌体DNA组成的克隆载体组成的克隆载体 质粒质粒DNA与染色体与染色体DNA片段组成的克隆载体等片段组成的克隆载体等第六张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月第七张,
4、PPT共一百二十一页,创作于2022年6月第八张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月第九张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月第十张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月根据用途可分为:根据用途可分为:根据用途可分为:根据用途可分为:表达克隆载体表达克隆载体表达克隆载体表达克隆载体 启动子探针型载体启动子探针型载体启动子探针型载体启动子探针型载体 cDNAcDNA克隆载体等克隆载体等克隆载体等克隆载体等根据应用对象可分为:根据应用对象可分为:根据应用对象可分为:根据应用对象可分为:原核生物克隆载体、植物克隆载体和动物克隆载体等。原核生物克隆载体、植物克隆载体和动物克隆载体
5、等。原核生物克隆载体、植物克隆载体和动物克隆载体等。原核生物克隆载体、植物克隆载体和动物克隆载体等。第十一张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月根据其复制或存在方式根据其复制或存在方式可分为可分为:自主复制型载体和附自主复制型载体和附加载体加载体 第十二张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月第四章第四章 基因克隆的质粒载体基因克隆的质粒载体第十三张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月质粒是存在于质粒是存在于细胞质细胞质中的一类中的一类独立于染色体独立于染色体的的自主复制自主复制的的遗传成份遗传成份.Plasmid一词由一词由Joshua Lederberg于于1952年
6、提出。年提出。质粒的命名质粒的命名:例例:pBR322一、与构建克隆载体相关的质粒性质一、与构建克隆载体相关的质粒性质p代表质粒代表质粒;“BR”代表两位研究者代表两位研究者Bolivar和和Rogigerus姓氏的字首姓氏的字首,“322”是实验编号是实验编号.第十四张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月已在形形色色的细菌类群中发现,大多数质粒的宿主范围已在形形色色的细菌类群中发现,大多数质粒的宿主范围较窄,只能生存于亲缘关系很近的少数细菌种类中。较窄,只能生存于亲缘关系很近的少数细菌种类中。是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的
7、辅助性遗传单位。已进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝已进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝并将质粒分子精确地分配给子代细胞。并将质粒分子精确地分配给子代细胞。1.质粒的特点:质粒的特点:第十五张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月其复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。其复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。常常含有一些编码对细菌宿主有利的基因。常常含有一些编码对细菌宿主有利的基因。这些基因可赋予宿主迥然不同的特征,其中不少具有这些基因可赋予宿主迥然不同的特征,其中不少具有重要的医学和商业价值。由质粒产生的表型包括产生抗生重要的医学和商业价值。由质
8、粒产生的表型包括产生抗生素、大肠杆菌素、肠毒素、限制酶与修饰酶,以及降解复素、大肠杆菌素、肠毒素、限制酶与修饰酶,以及降解复杂的有机化合物等。杂的有机化合物等。第十六张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月质粒通过合成长质粒通过合成长效致死物和短效效致死物和短效解毒剂得以在细解毒剂得以在细菌中生存菌中生存.第十七张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月质粒绝大多数是质粒绝大多数是质粒绝大多数是质粒绝大多数是环形双链环形双链环形双链环形双链的的的的DNADNA但也存在有线形质粒但也存在有线形质粒但也存在有线形质粒但也存在有线形质粒 、RNARNA质粒(酵母的杀伤质粒)质粒(酵母的杀伤
9、质粒)质粒(酵母的杀伤质粒)质粒(酵母的杀伤质粒)2.2.质粒的生物学特征质粒的生物学特征质粒的生物学特征质粒的生物学特征只能在在寄主细胞内独立增殖,随寄主分裂而遗传。只能在在寄主细胞内独立增殖,随寄主分裂而遗传。只能在在寄主细胞内独立增殖,随寄主分裂而遗传。只能在在寄主细胞内独立增殖,随寄主分裂而遗传。自然界中,无论是真核生物还是原核生物细胞,甚至真菌的自然界中,无论是真核生物还是原核生物细胞,甚至真菌的自然界中,无论是真核生物还是原核生物细胞,甚至真菌的自然界中,无论是真核生物还是原核生物细胞,甚至真菌的线粒体中都发现有质粒的存在。线粒体中都发现有质粒的存在。线粒体中都发现有质粒的存在。线
10、粒体中都发现有质粒的存在。质粒质粒质粒质粒DNADNA分子可以稳定存在于染色体外,呈游离状态分子可以稳定存在于染色体外,呈游离状态分子可以稳定存在于染色体外,呈游离状态分子可以稳定存在于染色体外,呈游离状态,有一些质粒有一些质粒有一些质粒有一些质粒在一定条件下能可逆地整合到寄主染色体上,随染色体的复在一定条件下能可逆地整合到寄主染色体上,随染色体的复在一定条件下能可逆地整合到寄主染色体上,随染色体的复在一定条件下能可逆地整合到寄主染色体上,随染色体的复制而复制制而复制制而复制制而复制,称为附加体。称为附加体。称为附加体。称为附加体。第十八张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月第十九张,
11、PPT共一百二十一页,创作于2022年6月3.3.环形双链环形双链环形双链环形双链DNADNA质粒分子组成与构型质粒分子组成与构型质粒分子组成与构型质粒分子组成与构型多数为双链环状多数为双链环状多数为双链环状多数为双链环状DNADNA分子分子分子分子.分子量从不足分子量从不足分子量从不足分子量从不足2kb2kb到到到到100kb100kb以上以上以上以上,多数为多数为10kb左右左右左右左右.具有三种不同的构型:具有三种不同的构型:具有三种不同的构型:具有三种不同的构型:共价闭合环形共价闭合环形共价闭合环形共价闭合环形DNA(cccDNA):DNA(cccDNA):两条多核苷酸链均保持完整的两
12、条多核苷酸链均保持完整的两条多核苷酸链均保持完整的两条多核苷酸链均保持完整的环形结构。环形结构。环形结构。环形结构。DNADNA呈超螺旋的呈超螺旋的呈超螺旋的呈超螺旋的SCSC构型。构型。构型。构型。开环开环开环开环DNA(ocDNA)DNA(ocDNA):有一条保持完整的环形结构,另一条链有一条保持完整的环形结构,另一条链有一条保持完整的环形结构,另一条链有一条保持完整的环形结构,另一条链出现有一至数个缺口。即出现有一至数个缺口。即出现有一至数个缺口。即出现有一至数个缺口。即OCOC构型。构型。构型。构型。线性分子(线性分子(线性分子(线性分子(lDNA)lDNA):经限制性内切酶切割之后,
13、双链断裂而经限制性内切酶切割之后,双链断裂而经限制性内切酶切割之后,双链断裂而经限制性内切酶切割之后,双链断裂而形成。称形成。称形成。称形成。称L L构型。构型。构型。构型。第二十张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月什么是超螺旋什么是超螺旋(superhelix 或或supercoil)?DNADNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的,当双螺是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的,当双螺 旋旋DNADNA的这个轴再弯曲缠绕时,的这个轴再弯曲缠绕时,DNADNA就处于超螺旋状态,就处于超螺旋状态,DNADNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNADN
14、A三级结构三级结构 的一个重要特征。的一个重要特征。正超螺旋正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与盘绕方向与DNA双螺旋方同相同双螺旋方同相同 负超螺旋负超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与盘绕方向与DNA双螺旋方向相反双螺旋方向相反 第二十一张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月第二十二张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月4.4.作为克隆载体质粒的条件作为克隆载体质粒的条件作为克隆载体质粒的条件作为克隆载体质粒的条件适于作为基因克隆载体的所有质粒适于作为基因克隆载体的所有质粒适于作为基因克隆载体的所有质粒适于作为基因克隆载体的所有质粒
15、DNADNA分子,都必须包括分子,都必须包括分子,都必须包括分子,都必须包括三种共同的组分:三种共同的组分:三种共同的组分:三种共同的组分:复制子复制子复制子复制子选择性标记基因选择性标记基因选择性标记基因选择性标记基因克隆位点克隆位点克隆位点克隆位点基因克隆载体还需要满足具有较小的分子量和较高的拷贝数基因克隆载体还需要满足具有较小的分子量和较高的拷贝数基因克隆载体还需要满足具有较小的分子量和较高的拷贝数基因克隆载体还需要满足具有较小的分子量和较高的拷贝数第二十三张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月 根据分子特性,革兰氏阴性细菌的质粒可分为两种根据分子特性,革兰氏阴性细菌的质粒可分为
16、两种根据分子特性,革兰氏阴性细菌的质粒可分为两种根据分子特性,革兰氏阴性细菌的质粒可分为两种接合型接合型接合型接合型 又叫自主转移的质粒又叫自主转移的质粒又叫自主转移的质粒又叫自主转移的质粒具有自主复制所必须的遗传信息之外,还带有一套具有自主复制所必须的遗传信息之外,还带有一套具有自主复制所必须的遗传信息之外,还带有一套具有自主复制所必须的遗传信息之外,还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。控制细菌配对和质粒接合转移的基因。控制细菌配对和质粒接合转移的基因。控制细菌配对和质粒接合转移的基因。可以在不同细胞间转移。可以在不同细胞间转移。可以在不同细胞间转移。可以在不同细胞间转移。非接合型的
17、质粒非接合型的质粒非接合型的质粒非接合型的质粒 不能自我转移的质粒,失去控制细菌配对和质粒接合不能自我转移的质粒,失去控制细菌配对和质粒接合不能自我转移的质粒,失去控制细菌配对和质粒接合不能自我转移的质粒,失去控制细菌配对和质粒接合转移的基因。转移的基因。转移的基因。转移的基因。不能自主转移。不能自主转移。不能自主转移。不能自主转移。5、质粒的类型质粒的类型第二十四张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月F质粒的质粒的tra区包含细菌接合所需的基因区包含细菌接合所需的基因第二十五张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月第二十六张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月质粒的转移
18、与迁移质粒的转移与迁移.转移一般指一个质粒独立地从一个细胞转移到另一个细胞转移一般指一个质粒独立地从一个细胞转移到另一个细胞.迁移则指本身不能转移迁移则指本身不能转移,在另一个接合型质粒存在下在另一个接合型质粒存在下,从一个细从一个细胞移至另一种细胞胞移至另一种细胞.质粒迁移的条件质粒迁移的条件(自身编码)(自身编码)bom位点位点(col E1)nic 位点位点.mob基因基因.结合动员基因结合动员基因.编码迁移蛋白编码迁移蛋白,实质是一种核酸酶实质是一种核酸酶,切割切割nic位点位点.迁移作用迁移作用(mobiligation):由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程由共存接合型质粒
19、引发的非接合型质粒的迁移过程.第二十七张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月第二十八张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月从基因工程安全角度考虑,接合型质粒不宜作为克隆载体。从基因工程安全角度考虑,接合型质粒不宜作为克隆载体。从基因工程安全角度考虑,接合型质粒不宜作为克隆载体。从基因工程安全角度考虑,接合型质粒不宜作为克隆载体。因为从理论上存在着发生使跨越生物种间遗传屏障因为从理论上存在着发生使跨越生物种间遗传屏障的潜在危险的潜在危险.而利用迁移作用可能将非接合型质粒从一种细胞转移至另而利用迁移作用可能将非接合型质粒从一种细胞转移至另一种细胞一种细胞,这种方法叫这种方法叫三亲杂
20、交法三亲杂交法.一般将受体菌、供体菌及辅助转移菌一般将受体菌、供体菌及辅助转移菌 三者共培养过夜三者共培养过夜.在基因工程中得到大量的应用在基因工程中得到大量的应用.第二十九张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月三亲杂交法三亲杂交法第三十张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月根据质粒的性状特征,可分为五种不同的类型:根据质粒的性状特征,可分为五种不同的类型:F(F(Fertility)Fertility)质粒质粒质粒质粒:(Resistance)Resistance)质粒质粒质粒质粒ColCol质粒质粒质粒质粒降解质粒(降解质粒(降解质粒(降解质粒(Degradative pl
21、asmidsDegradative plasmids)致瘤质粒(致瘤质粒(致瘤质粒(致瘤质粒(Virulence plasmidsVirulence plasmids)农杆菌)农杆菌)农杆菌)农杆菌TiTi质粒质粒质粒质粒第三十一张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月根据质粒的转移功能分类根据质粒的转移功能分类第三十二张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月根据质粒的表现分为根据质粒的表现分为:定义:质粒除了与控制本身复制和转移相关的基因外,定义:质粒除了与控制本身复制和转移相关的基因外,有的质粒还携带一些其他的基因,宿主细胞由于含有有的质粒还携带一些其他的基因,宿主细胞由于含有
22、这样的质粒而呈现出新的性状,这样的质粒称为显性质这样的质粒而呈现出新的性状,这样的质粒称为显性质粒。粒。相反,即使宿主细胞含有某种质粒,但无异样性状表露,相反,即使宿主细胞含有某种质粒,但无异样性状表露,这样的质粒称为隐蔽质粒。这样的质粒称为隐蔽质粒。受检测手段的限制,现定为隐蔽型的质粒未必是真正的受检测手段的限制,现定为隐蔽型的质粒未必是真正的隐蔽质粒。隐蔽质粒。显性质粒和隐蔽质粒显性质粒和隐蔽质粒第三十三张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月人工构建的质粒根据其功能及用途分为:(1)多拷贝质粒多拷贝质粒 (2)测序质粒测序质粒 (3)整合质粒整合质粒 (4)穿梭质粒穿梭质粒 (5)
23、表达质粒表达质粒 (6)探针质粒探针质粒第三十四张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月质粒的复制子决定其拷贝数。质粒的复制子决定其拷贝数。复制子是一个遗传单位,包括复制子是一个遗传单位,包括DNA复制起点复制起点,相关的调控元相关的调控元件件,复制终点。复制终点。6、质粒的复制、质粒的复制复制起点是一段特定的复制起点是一段特定的DNA片段,长约几百碱基对,其相关片段,长约几百碱基对,其相关的顺式作用调控元件中含有参与的顺式作用调控元件中含有参与DNA合成起始的由质粒或宿合成起始的由质粒或宿主编码的可扩散因子的结合位点。主编码的可扩散因子的结合位点。定义:质粒定义:质粒DNA中能自主复制
24、并维持正常拷贝数的一段最小中能自主复制并维持正常拷贝数的一段最小的核酸序列单位。的核酸序列单位。第三十五张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月 与一个起始点相连而没有被终点隔断的任何序列与一个起始点相连而没有被终点隔断的任何序列,都是作为复制子的一部分而被复制都是作为复制子的一部分而被复制.起始点是一种顺式作用位点起始点是一种顺式作用位点,只能作用于该位点所只能作用于该位点所在的在的DNA分子分子.第三十六张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月质粒的拷贝数定义质粒的拷贝数定义:(1)通常定义通常定义:生长在标准培养条件下生长在标准培养条件下(LB培养基培养基)每个细菌细胞每个细
25、菌细胞中平均所含有的质粒的拷贝数中平均所含有的质粒的拷贝数.(2)特殊定义特殊定义:在营养富有余的培养基中在营养富有余的培养基中,每个细胞当中每条每个细胞当中每条染色体所拥有的平均质粒染色体所拥有的平均质粒DNA分子数分子数.(3)中定义中定义:在在LB液体培养基中生长的每个细胞液体培养基中生长的每个细胞,如果具有如果具有20个及以上的个及以上的质粒质粒DNA分子分子,就叫高拷贝质粒就叫高拷贝质粒,如果低于如果低于20个则叫低拷贝质个则叫低拷贝质粒粒.第三十七张,PPT共一百二十一页,创作于2022年6月 质粒就其复制方式而言分为两类:质粒就其复制方式而言分为两类:严紧型严紧型(stringe
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