电镜超薄切片1.pptx
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1、The photo of light microscope第1页/共56页第2页/共56页冷冻蚀刻超薄切片第3页/共56页冰冻蚀刻复型术冰冻蚀刻复型术Freezeetchreplica第4页/共56页冰冻割断术冰冻割断术电镜细胞化学术电镜细胞化学术Freezecrackingelectronmicroscopecytochemistry第5页/共56页免疫组织化学技术免疫组织化学技术免疫电镜术免疫电镜术ImmunohistochemistryImmunoelectronmicroscopy第6页/共56页电镜放射自显影术电镜放射自显影术显微放射自显影技术显微放射自显影技术Electronmic
2、roscopeAutoradiographyMicroautoradiography第7页/共56页扫描电镜技术扫描电镜技术ScanningelectronmicroscopySEM被吞噬的红细胞第8页/共56页现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类:现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类:一类是透射电镜的基本制备技术,包一类是透射电镜的基本制备技术,包括超薄切片和负染色法;括超薄切片和负染色法;另一类是生物制品的特殊技术,其中另一类是生物制品的特殊技术,其中包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、电镜细胞化学术包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、电镜细胞化学术、免疫电镜术、电镜放射自显影技术、免疫电镜术、电镜放
3、射自显影技术、X线微区分析技术等。线微区分析技术等。第9页/共56页1 1、超薄切片样品的制备超薄切片样品的制备(1 1)取材取材(基本要求是在活体情况下进行基本要求是在活体情况下进行)取材的原则取材的原则(快、准、轻、小、冷的原则)快、准、轻、小、冷的原则)1 1)快速:快速:1 1分钟之内投入固定液。分钟之内投入固定液。2 2)块小:块小:0.5-10.5-1mmmm3 3或截面或截面1 1mmmm2 2的长条。的长条。3 3)部位准部位准4 4)损伤小:器械应锐利,避免牵拉、挤压,防止组织受机械损伤。损伤小:器械应锐利,避免牵拉、挤压,防止组织受机械损伤。5 5)低温:低温:0-40-4
4、o oC C第10页/共56页取材的方法1 1)动物材料:对神经组织等要进行原位固定或灌注固定,待组织适当硬化后再取材。第11页/共56页胚胎干细胞的研究第12页/共56页2 2)培养细胞(Cell culture)(Cell culture):生长在瓶中的细胞到足够的量,先倒去培养液,然后倒入适量的戊二醛固定液,在冰浴下3-53-5分钟、弯头吸管吹打或用软器械轻轻地刮下贴壁的细胞,将这种混合液倒入离心管中,20002000rpmrpm低速离心15-2015-20分钟,使细胞呈团,弃去上清液,换一次固定液,将其移入修块台,修快成标准块4 4o oC C固定、待用。第13页/共56页3 3)单细
5、胞悬液:精子、血球等其他不易聚集的悬浮游离材料,可加入等量的戊二醛和其他类型的固定液,轻轻地把他们悬浮在固定液中。经过固定处理后再离心成团,在5050o oC C中弃去上清液,加入适量的经5050o oC C预温的2%2%的琼浆,使团悬浮,将悬浮团和琼脂液一同在薄片上展层,固定后切成1 1mmmm3 3的小块。第14页/共56页(2 2)固定 (fixation)The aim is to avoid digestion by enzymes(autolysis)or bacteriaand to preserve the physical structure,pieces of organs
6、 should bepromptly and adequately treated before or as soon as possible afterremovalfromtheanimalsbody.第15页/共56页1 1)Function of fixationFunction of fixationA A阻止细胞自溶。阻止细胞自溶。B B 稳定细胞物质成分。稳定细胞物质成分。C C 在一些组分的分子之间以化学反应和物理反应建立铰链,提供一个骨架来稳定各种细胞的空间结构。在一些组分的分子之间以化学反应和物理反应建立铰链,提供一个骨架来稳定各种细胞的空间结构。D能提供一定的电子反差能提
7、供一定的电子反差第16页/共56页 理想的固定剂,应具备以下条件:能迅速而均匀地渗入组织细胞内部,稳定细胞内各种成分;能即刻将细胞“杀死”,尽可能保持细胞微细结构,减少死后变化;对细胞不产生收缩及膨胀作用,不产生人工假象及变形;可保存酶的活性,以利于细胞化学测定工作的进行。第17页/共56页2 2)影响固定效果的因素固定液的pHpH值渗透压缓冲液的类型固定的温度和时间当前采用的是在0 04 4下固定下固定1 1 4 4小时。第18页/共56页3 3)常用的几种固定剂)常用的几种固定剂A A 四四氧氧化化锇锇(osmium osmium tetroxide,OsO4tetroxide,OsO4)
8、亦亦称称锇锇酸酸:锇锇酸酸实实际际上上不不是是酸酸,它它的的水水溶溶液液是是中中性性的的,为为一一种种强强氧氧化化剂剂。0.5-10.5-1g g包包装装,淡淡黄黄色色晶晶体体。具具有有挥挥发发性性和和毒毒性性,在在室室温温下下易易挥挥发发,其其蒸蒸气气对对粘粘膜膜有有刺刺激激作作用用,在通风橱内配制。在通风橱内配制。第19页/共56页优优点点对对蛋蛋白白质质、磷磷酸酸脂脂蛋蛋白白、核核蛋蛋白白固固定定较较好好;对对脂脂类类固固定定较较好好。分分子子密密度度高高,产生良好的反差,因此锇酸固定本身也起到生物染色作用。产生良好的反差,因此锇酸固定本身也起到生物染色作用。缺缺点点不不能能固固定定糖糖
9、元元和和核核酸酸,对对微微管管固固定定较较差差。扩扩散散慢慢,穿穿透透能能力力差差。具具有有挥挥发发性性和和粘膜毒性。粘膜毒性。不适于进行细胞化学工作。不适于进行细胞化学工作。第20页/共56页B B戊二醛(戊二醛(glutaraldehyde,Cglutaraldehyde,C5 5H H8 8O O2 2)特特点点:纯纯的的容容易易聚聚合合,目目前前使使用用25%25%水水溶溶液液进进口口分分装装。存存放放时时间间久久了了容容易易变变质质,影影响响固固定。定。优优点点(1)对对组组织织穿穿透透力力强强。(2)能能保保存存某某些些酶酶的的活活性性,对对糖糖元元、细细胞胞膜膜、核核基基质质等等
10、有有较较好的作用。好的作用。(3)而且组织块在溶液中可保存较长的时间,适用于进行超微细胞化学研究。而且组织块在溶液中可保存较长的时间,适用于进行超微细胞化学研究。第21页/共56页C甲醛(甲醛(fomaldehyde):多用多聚甲醛粉剂配制。其分子小,渗透力强,固定迅速,对多用多聚甲醛粉剂配制。其分子小,渗透力强,固定迅速,对酶的活性保存好。酶的活性保存好。第22页/共56页2 2)固定的方法)固定的方法A A 单固定法:单细胞或固定液易于浸透的组织单固定法:单细胞或固定液易于浸透的组织 1-2%1-2%四氧化锇(四氧化锇(1-21-2h h)。)。B B 双固定法:戊二醛(双固定法:戊二醛(
11、2.5%42.5%4o oC 2hC 2h)-锇酸(锇酸(1%41%4o oC 2hC 2h)。)。C C 原位固定和灌注固定:原位固定和灌注固定:第23页/共56页附附 几种常见固定剂的配制几种常见固定剂的配制 固固定定液液的的PHPH值值6.0-8.06.0-8.0,常常用用PHPH值值7.2-7.4,7.2-7.4,对对含含水水较较多多的的组组织织可可用用PHPH值值8.08.0,细细菌菌、病病毒毒可可用用PHPH值值在在7.07.0以下。以下。0.0.2 2mol/Lmol/L磷酸缓冲液的配制磷酸缓冲液的配制 磷酸二氢钠(磷酸二氢钠(NaHNaH2 2POPO4 4.H.H2 2O O
12、)2.6g 2.6g 磷酸氢二钠(磷酸氢二钠(NaNa2 2HPOHPO4 4.12H.12H2 2O O)29g 29g 重蒸水重蒸水 加到加到500500mlml 调调PHPH到到7.47.4第24页/共56页0.20.2mol/Lmol/L二甲坤酸盐酸缓冲液二甲坤酸盐酸缓冲液重蒸水重蒸水 25 25mlml二甲坤酸钠(二甲坤酸钠(Na(CHNa(CH3 3)2AsO2.3H)2AsO2.3H2 2O O)2.14g 2.14g0.0.1mol/L1mol/L盐酸盐酸 8 8mlml重蒸水重蒸水 加至加至5050mlml调调PH到到7.4第25页/共56页B B 固定液的配制固定液的配制锇
13、酸固定液的配制锇酸固定液的配制2%2%的锇酸固定液的配制:清洗烘干器皿的锇酸固定液的配制:清洗烘干器皿 1 1G G锇酸锇酸+50+50mlml双蒸水(棕色瓶)数日可用。双蒸水(棕色瓶)数日可用。0.10.1mol/Lmol/L磷酸盐缓冲液或二甲坤酸盐缓冲液配制的磷酸盐缓冲液或二甲坤酸盐缓冲液配制的1%1%锇酸固定液。锇酸固定液。2%2%的的锇锇酸酸缓缓冲冲液液 1010ml ml 0.2mol/L0.2mol/L缓缓冲冲液液 1010mlml 调节调节PHPH应为应为7.3-7.47.3-7.4第26页/共56页戊二醛固定液的配制戊二醛固定液的配制25%25%戊二醛(戊二醛(mlml)0.4
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