质粒与载体学习.pptx
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1、1.1.质粒概述质粒概述质粒(质粒(plasmidplasmid):):一种独立于染色体外,能进行自主复制的细胞质遗传一种独立于染色体外,能进行自主复制的细胞质遗传因子,主要存在于各种微生物细胞中。因子,主要存在于各种微生物细胞中。第1页/共65页1.1 1.1 质粒的分子结构质粒的分子结构通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中;也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒;疏螺旋体、链霉菌和酵母菌疏螺旋体、链霉菌和酵母菌第2页/共65页1.2 1.2 质粒的检测质粒的检测t 提取所有胞内DNA后电镜观察;t 超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察;通常用碱裂解法提取质粒通常用碱裂解法提取质粒
2、第3页/共65页1.3 1.3 质粒的命名质粒的命名第第1个字母个字母(小写小写):p,质粒(质粒(plasmid);第第2,3 个字母(大写):人名,实验室名,表型个字母(大写):人名,实验室名,表型性状或其他特征的英文缩写性状或其他特征的英文缩写;编号(阿拉伯数字)编号(阿拉伯数字):区别同一类型的不同质粒:区别同一类型的不同质粒例:例:pUC18,pUC19第4页/共65页1.4 1.4 质粒的主要类型质粒的主要类型质粒与宿主的关系:质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的;在某些特殊条件下,质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能,从而使宿主得到生长优势。第5页/共65页质粒的主要类型质粒的主
3、要类型(P202)质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应致育因子(Fertility factor,F因子)抗性因子(Resistance factor,R因子)产细菌素的质粒(Bacteriocin production plasmid)毒性质粒(virulence plasmid)代谢质粒(Metabolic plasmid)隐秘质粒(cryptic plasmid)第6页/共65页1.5 1.5 质粒的一般特性质粒的一般特性非必要遗传物质非必要遗传物质一般控制次要性状,能自我复制并稳定遗传。质粒的一般控制次要性状,能自我复制并稳定遗传。质粒的存在一般也有助于生物在特殊环境下的生长;存在一般
4、也有助于生物在特殊环境下的生长;在细胞内的大小和数量不相同在细胞内的大小和数量不相同一般大质粒(分子量一般大质粒(分子量60M60M道尔顿)拷贝数少,小质粒道尔顿)拷贝数少,小质粒(分子量(分子量15M15M道尔顿)拷贝数较多。氯霉素等可抑制道尔顿)拷贝数较多。氯霉素等可抑制染色体染色体DNADNA复制而使质粒拷贝数扩增;复制而使质粒拷贝数扩增;第7页/共65页互不相容性互不相容性属于同一组并具有共同阻遏物的质粒不能在同一细属于同一组并具有共同阻遏物的质粒不能在同一细胞并存;胞并存;具有可转移性及稳定性具有可转移性及稳定性以较高频率(以较高频率(1010-6-6),通过细胞间的接合作用或其),
5、通过细胞间的接合作用或其它机制从供体转移至受体,在细胞分裂前复制,均等它机制从供体转移至受体,在细胞分裂前复制,均等分配至子细胞中;分配至子细胞中;可整合性可整合性在一定条件下,质粒可以整合到染色体在一定条件下,质粒可以整合到染色体DNADNA上,并可重上,并可重新脱落下来新脱落下来第8页/共65页可重组性可重组性不同质粒或质粒与染色体上的基因可以在细胞内或细不同质粒或质粒与染色体上的基因可以在细胞内或细胞外进行交换并形成新的重组质粒;胞外进行交换并形成新的重组质粒;可消除性可消除性经高温、吖啶橙或丝裂霉素经高温、吖啶橙或丝裂霉素C C等可以消除质粒,宿主等可以消除质粒,宿主细胞同时也失去质粒
6、所携带的表型性状细胞同时也失去质粒所携带的表型性状;耐碱性耐碱性与染色体与染色体DNADNA相比,质粒有较高的耐碱性,调相比,质粒有较高的耐碱性,调pHpH至至12.4 12.4,可使染色体,可使染色体DNADNA变性,通过离心将其与质粒变性,通过离心将其与质粒分离分离第9页/共65页2.2.质粒的复制和调节质粒的复制和调节2.1 2.1 质粒的大小质粒的大小常见质粒大小的范围为常见质粒大小的范围为1 1200kb200kb,个别大质粒可达,个别大质粒可达8008001000 kb1000 kb质粒的大小常用分子量质粒的大小常用分子量MDMD或碱基对数或碱基对数kbkb来表示。来表示。1MD1
7、MD的双链的双链DNA1.65kbDNA1.65kb。未知质粒的大小通常可以在相同条件下与已知其大小的几个未知质粒的大小通常可以在相同条件下与已知其大小的几个标准质粒比较并依其电泳距离作图来估算。标准质粒比较并依其电泳距离作图来估算。最精确的测定需要对质粒最精确的测定需要对质粒DNADNA作序列分析,然后从所含碱基作序列分析,然后从所含碱基数目来直接推算出其大小和分子量数目来直接推算出其大小和分子量。第10页/共65页2.2 2.2 质粒的拷贝数质粒的拷贝数质粒的数量亦称为质粒在每一细胞中存在的拷贝数质粒的数量亦称为质粒在每一细胞中存在的拷贝数(copy number)(copy number
8、)不同质粒在细胞中的拷贝数各异。不同质粒在细胞中的拷贝数各异。一般而言,质粒的拷贝数与其分子量成反比关系,分子量大的一般而言,质粒的拷贝数与其分子量成反比关系,分子量大的拷贝数低,分子量小的拷贝数高。如拷贝数低,分子量小的拷贝数高。如F F因子这一类质粒,每个因子这一类质粒,每个细胞中只有细胞中只有1 12 2个拷贝的质粒,它们的复制受到严格控制,个拷贝的质粒,它们的复制受到严格控制,称为严紧型质粒称为严紧型质粒(stringent plasmids)(stringent plasmids)或低拷贝质粒。或低拷贝质粒。分子量小的分子量小的(如如ColE1ColE1质粒质粒)拷贝数高,每个细胞中
9、有拷贝数高,每个细胞中有1010100100个个拷贝的质粒,说明它们的复制不受到严格控制,称为松弛型拷贝的质粒,说明它们的复制不受到严格控制,称为松弛型质粒质粒(relaxed plasmids)(relaxed plasmids)或高拷贝质粒。基因工程中为获得大或高拷贝质粒。基因工程中为获得大量的基因产物所用的载体质粒便是这类松弛型质粒。量的基因产物所用的载体质粒便是这类松弛型质粒。第11页/共65页2.3 2.3 质粒复制的模型质粒复制的模型复制子复制子(replicon)(replicon)是一个复制单位,细菌染色体是一个复制子,是一个复制单位,细菌染色体是一个复制子,每一个质粒也是一个
10、复制子。复制起点是复制子起始复制的每一个质粒也是一个复制子。复制起点是复制子起始复制的部位,作为一个复制子部位,作为一个复制子,至少需要有一个复制起点至少需要有一个复制起点,即即oriori位点位点。大肠杆菌染色体的复制起点称为大肠杆菌染色体的复制起点称为oriCoriC,质粒的复制起点叫做,质粒的复制起点叫做oriVoriV。质粒的复制主要是通过质粒的复制主要是通过型复制和滚环复制两种方式之一进行的,型复制和滚环复制两种方式之一进行的,其中以其中以型复制为主。在型复制为主。在型复制中,有单向复制和双向复制两型复制中,有单向复制和双向复制两种类型,如种类型,如R1R1、R100R100等的复制
11、是单向的,而等的复制是单向的,而F F和和R6kR6k是双向复制是双向复制类型。类型。第12页/共65页 质粒只编码一种或少数几种与复制有关的蛋白质。质粒只编码一种或少数几种与复制有关的蛋白质。而而复复制制所所需需要要的的其其它它蛋蛋白白,如如DNADNA聚聚合合酶酶、连连接接酶酶、引引物物酶酶、连连接接酶酶、RNA-HRNA-H酶酶、解解旋旋酶酶(gyrase)(gyrase)和和拓拓扑扑异异构构酶酶I I、dnaBdnaB 和和dnaCdnaC基基因因产产物物(沿沿链链延延伸伸的的DNADNA合合成成酶酶)等等都都是是利利用用寄主的复制酶体系。寄主的复制酶体系。复制起点复制起点(ori)o
12、ri)区的功能区的功能 ori ori位点周围的小范围位点周围的小范围DNADNA是质粒复制所必需的是质粒复制所必需的在大多数质粒中,与复制有关的蛋白质基因位于它们的作用在大多数质粒中,与复制有关的蛋白质基因位于它们的作用位点位点-ori-ori序列附近序列附近将将oriori区克隆到一个不能自主复制的环状双链区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNADNA分子上并引分子上并引入原核细胞后入原核细胞后,该重组该重组DNADNA具有自主复制能力。具有自主复制能力。第13页/共65页pBR322pBR322是最早人工构建的质粒载体。通过将下面几部分不同是最早人工构建的质粒载体。通过将下面几部分不同来
13、源的来源的DNADNA片段连接起来而构成的环状质粒片段连接起来而构成的环状质粒:来源于来源于ColE1ColE1的衍生质粒的衍生质粒pMB1 pMB1 的的DNADNA复制起点复制起点(oriori)及及roprop区;区;来源于质粒来源于质粒pSC101pSC101的四环素抗性基因的四环素抗性基因(tettetr r);来源于转座子来源于转座子Tn3Tn3的氨卞青霉素抗性基因的氨卞青霉素抗性基因(ampampr r)。第14页/共65页 ori ori区域常决定了质粒的许多特性,如质粒的寄主范围和区域常决定了质粒的许多特性,如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。质粒的拷贝数。质粒如质粒如ColE1
14、ColE1类型的质粒,包括类型的质粒,包括pBR322pBR322、pETpET和和pUCpUC具具有较窄的寄主范围,这些质粒只在有较窄的寄主范围,这些质粒只在E.coliE.coli 及一些亲缘关系较及一些亲缘关系较近的如沙门氏菌近的如沙门氏菌(SalmonellaSalmonella)和克氏杆菌和克氏杆菌(KlebsiellaKlebsiella)中复制。中复制。RP4RP4、RK2RK2和和RSF1010RSF1010及从及从G+G+细菌中分离的滚环复制的质粒都细菌中分离的滚环复制的质粒都属于广寄主范围属于广寄主范围(broad host range)(broad host range)
15、质粒。广寄主范围的质粒质粒。广寄主范围的质粒一般是编码与复制起始有关的所有蛋白,这样就不依赖于寄一般是编码与复制起始有关的所有蛋白,这样就不依赖于寄主的功能。主的功能。第15页/共65页2.4 2.4 质粒复制的调控质粒复制的调控质粒的复制机制同染色体基本相同质粒的复制机制同染色体基本相同质粒的复制的调控主要是控制拷贝数质粒的复制的调控主要是控制拷贝数质粒的复制质粒的复制复制调控机制一般采用直接或间接复制调控机制一般采用直接或间接 的负调控机制。的负调控机制。负调控因子可以是蛋白质、负调控因子可以是蛋白质、RNARNA或或DNADNA重复序列重复序列。抑制物抑制物-靶位调控靶位调控(inhib
16、itor-target regulation(inhibitor-target regulation)其特点是依赖一小段反向转录的其特点是依赖一小段反向转录的RNARNA作为抑制物,作为抑制物,通过它与目标通过它与目标RNARNA的互补结合以阻止质粒复制的起始。的互补结合以阻止质粒复制的起始。第16页/共65页目标目标RNARNA是质粒是质粒DNADNA复制的引物或是用于编码复复制的引物或是用于编码复制所需的制所需的RepRep蛋白的蛋白的mRNAmRNA。属于这一复制调控类型的质粒包括属于这一复制调控类型的质粒包括ColE1ColE1、pT181pT181、p15Ap15A、pMB1pMB1
17、、RSF1010RSF1010、loDF13 loDF13、R1R1等等ColE1ColE1质粒质粒复制调控复制调控 ColE1ColE1质粒复制调控质粒复制调控 6.6kb 6.6kb的小质粒,拷贝数的小质粒,拷贝数10-2010-20复制不需要质粒编码蛋白质,而是依赖于宿主的复制酶体系复制不需要质粒编码蛋白质,而是依赖于宿主的复制酶体系 从一个固定原点从一个固定原点oriVoriV开始,进行单向复制开始,进行单向复制。第17页/共65页ColE1ColE1的复制需要一个的复制需要一个RNARNA引物。引物。RNARNA是质粒复制的引物前体是质粒复制的引物前体,P,PRNARNA是编码是编码
18、RNARNA的启的启动子动子,RNA,RNA转录是在转录是在RNARNA聚合酶作用下,从复制原点上聚合酶作用下,从复制原点上游方向游方向555bp 555bp 处起始转录处起始转录(将将RNARNA与与DNADNA的转换处定为复的转换处定为复制原点制原点)。当这个。当这个RNARNA延伸至复制原点延伸至复制原点oriVoriV时,由时,由RNAase H RNAase H 将将RNARNA切断,从而产生切断,从而产生3 3-OH-OH末端。然后末端。然后DNADNA聚合酶以此为引物合成聚合酶以此为引物合成DNADNA,复制从起始点,复制从起始点oriVoriV开始向右开始向右进行。进行。第18
19、页/共65页3553oriVL or Light strandH or Heavy strandNew L Strand synthesised firstONLY 580 bps needed for plasmid to replicate in host cell-555RNAIIRNAI-445RNA PolymeraseRNAII starts at-555 on H strandColE1ColE1的复制的复制第19页/共65页-445-5553-445Transcription beyond oriVHybridisation at/near oriV-55533RNAaseH
20、cleaves at oriV2/3 bp accuracy-445ONLY 580 bps needed and ONLY 13 after oriV第20页/共65页质粒编码的两个负调控因子质粒编码的两个负调控因子RopRop蛋白质和反义蛋白质和反义RNARNA(RNA)(RNA),控制了,控制了DNADNA复制过程中所必需的引物复制过程中所必需的引物的合成。的合成。在在ColE1ColE1复制原点上游方向复制原点上游方向445 bp445 bp处处(相当于相当于RNARNA的第的第111111个碱基的位置个碱基的位置)处起始转录另一个处起始转录另一个RNARNA分子,分子,其转录方向与其
21、转录方向与RNARNA相反,它是由双链相反,它是由双链DNADNA链上的链上的另一条链另一条链(C-(C-链链)为模板进行转录的,这个为模板进行转录的,这个RNARNA分子称分子称为为RNA IRNA I,属于反义,属于反义RNARNA。第21页/共65页上节课的总结上节课的总结1.1.原核生物基因组的特点原核生物基因组的特点2.2.质粒及载体质粒及载体1 1).质粒的概念及种类质粒的概念及种类2 2).质粒复制模型质粒复制模型3 3).质粒复制的调控质粒复制的调控抑制物-靶位调控第22页/共65页这个反义这个反义RNA I RNA I 有有111111个碱基与个碱基与RNARNA的的5 5末
22、端互补,末端互补,这样这样,RNA I,RNA I与与RNARNA互补形成双链互补形成双链RNARNA结构结构,使之不使之不能为能为RNAase HRNAase H所识别所识别(人们通常认为人们通常认为RNAase HRNAase H只识只识别别DNA-RNADNA-RNA杂合双链,而不识别双链杂合双链,而不识别双链RNARNA结构结构)。RNARNA的转录继续进行,不能在分子原点区域产生有的转录继续进行,不能在分子原点区域产生有活性的引物而对复制起负调控作用。因此,活性的引物而对复制起负调控作用。因此,RNA IRNA I控控制着质粒的拷贝数。制着质粒的拷贝数。这个机理解释了这个机理解释了C
23、olEColE质粒的拷贝数调控质粒的拷贝数调控,由于由于RNA IRNA I是由质粒编码合成的是由质粒编码合成的,当质粒的浓度高时当质粒的浓度高时,就会产生较就会产生较多的多的RNA IRNA I分子分子,而高浓度的而高浓度的RNA IRNA I就会来又干扰就会来又干扰RNARNA的加工的加工,从而抑制复制。从而抑制复制。第23页/共65页一般当一个细胞中一般当一个细胞中ColEColE的拷贝数达到的拷贝数达到1616时时,就会几乎就会几乎完全抑制质粒的复制。完全抑制质粒的复制。调控蛋白调控蛋白,rop,rop基因位于基因位于 ColE1ColE1复制原点下游方向不远复制原点下游方向不远处。处
24、。RopRop蛋白增强了蛋白增强了RNA1RNA1和和RNA2RNA2的相互作用,从的相互作用,从而加强了而加强了RNA IRNA I的抑制作用。的抑制作用。反义反义RNARNA对质粒复制的抑制作用,控制着质粒的拷对质粒复制的抑制作用,控制着质粒的拷贝数,反义基因发生突变将会增进引物的形成和质贝数,反义基因发生突变将会增进引物的形成和质粒的复制,即增加其拷贝数。野生型粒的复制,即增加其拷贝数。野生型ColE1ColE1的拷贝数的拷贝数约是约是2020个个 /每个细胞,当反义基因发生缺陷时,其每个细胞,当反义基因发生缺陷时,其拷贝数超过拷贝数超过250250,第24页/共65页+600 +400
25、 -500 Rop/Rom Dimer5353RNAase cut3oriVSummary of ColE1 replication controlRNAIRNAII第25页/共65页R1R1质粒复制调控质粒复制调控R1R1质粒约质粒约90kb90kb,拷贝数为每个细胞,拷贝数为每个细胞1-21-2个。个。RepARepA蛋白是质粒复制起始必需的因子。由蛋白是质粒复制起始必需的因子。由repArepA基因编码,有基因编码,有两个转录启动子,两个转录启动子,P PcopBcopB和和P PrepArepA。从。从P PcopBcopB转录产生转录产生CopBCopB和和RepARepA两个产物。
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