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1、CRISPR科普版PPT01020403CONTENTSCRISPR:Clustered regularly interspaced short palindromic repeats 成簇规律间隔短回文重复序列系统CRISPR:spacers(间隔序列)+direct repeats(重复序列)基因座结构:5-tracr RNA-Cas9-CRISPR-3tracrRNA:trans-activating CRISPR RNAcrRNA:CRISPR RNA(pre-crRNA)Cas 9:CRISPR associated endonuclease9sgRNA:single-guide R
2、NAPAM序列:protospacer adjacent motif 原间隔序列临近基序DSBs:double-strand breaks 双链DNA缺口NHEJ:nonhomologous end-joining 非同源末端连接HDR:homology-directed repair 同源重组修复2.1 相关名词sgRNAProtospacer-PAM外源DNA原间隔序列视频:CRISPR-Cas9基因编辑的原理(张锋亲自参与制作)网址:http:/ CRISPR的原理 2.3 从结构生物学角度解析CRISPR系统 Cas9 binds DNA and gRNA(视频)2.4 一些有意思的东
3、西 CONTENTS 目录PART ONE 第一部分PART TWO 第二部分PART THREE 第三部分PART FOUR 第四部分行业分析 项目目的 进度安排 预算需求 他们说,还有未被CRISPR染指的物种吗?改造人类胚胎改造人类胚胎Protein&Cell中山大学基因功能研究人员黄军两篇代表性的论文推荐CONTENTS 目录PART ONE 第一部分PART TWO 第二部分PART THREE 第三部分PART FOUR 第四部分行业分析 项目目的 进度安排 预算需求 中国开启全球首个CRISPR基因编辑人体实验相关链接:http:/ VS.CRISPR基因黑客张锋!纽约客万字长文
4、讲述CRISPR背后的隐秘江湖!C1234基因敲除基因表达调控基因产物定位Genome-Scale5CRISPRiApplications1基因敲除基因敲除Knockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRilTarget设计:在你的目的位置附近找到NGG然后找到其紧邻的上游20 ntl一般选择距离起始密码子ATG下游200bp范围内的exon区域lCas9的切割位点刚好被一个酶切位点跨过l预测:Zifit;http:/crispr.mit.edu l合成两条配对的普通oligo,请注意突出的粘性末端以及补加的一个转录
5、起始位点G。gDNAgDNA设计设计Applications1基因敲除基因敲除Knockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRi1.Annealing Oligos2.Ligation3.Transformation and pick up clones for seq.4.Midi-prepare plasmid for transfection.gDNAgDNA设计设计克隆构建克隆构建Applications1基因敲除基因敲除Knockout,GeneExpressionRegulation,Orientatio
6、n,Gome-scale,CRISPRigDNAgDNA设计设计克隆构建克隆构建(Lukasz Swiech.et.al.2014)病毒包装病毒包装Applications1基因敲除基因敲除Knockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRigDNAgDNA设计设计克隆构建克隆构建病毒包装病毒包装目的细胞系的目的细胞系的感染感染/转染转染1.转染:(2 mg plasmid/60 mm dish,细胞密度60-80%)【v2=lentiCRISPR v2,下同】2.感染:(1-5 ml病毒上清)Applications
7、1基因敲除基因敲除Knockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRi1.直接测序、T7E1或者酶切鉴定2.WB鉴定Ps:脱靶效率鉴定3.表型、行为学层面 Eg:contextual fear-conditioning paradigm(Lukasz Swiech.et al,2014)gDNAgDNA设计设计克隆构建克隆构建病毒包装病毒包装目的细胞系的目的细胞系的感染感染/转染转染KO KO 效率鉴定效率鉴定2基因表达调控基因表达调控ApplicationsKnockout,GeneExpressionRegulat
8、ion,Orientation,Gome-scale,CRISPRi上调或下调基因表达(Francisco J.Snchez-Rivera et al,2015)gDNAgDNA设计设计克隆构建克隆构建病毒包装病毒包装目的细胞系的目的细胞系的感染感染/转染转染KO KO 效率鉴定效率鉴定2基因表达调控基因表达调控ApplicationsKnockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRigDNAgDNA设计设计克隆构建克隆构建病毒包装病毒包装目的细胞系的目的细胞系的感染感染/转染转染KO KO 效率鉴定效率鉴定(Fra
9、ncisco J.Snchez-Rivera et al,2015)3基因产物定位基因产物定位ApplicationsKnockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRigDNAgDNA设计设计克隆构建克隆构建病毒包装病毒包装目的细胞系的目的细胞系的感染感染/转染转染KO KO 效率鉴定效率鉴定基因产物定位有时候,我们想知道基因产物定位怎么办?融合标签啊!怎么融合?同源重组修复能帮到你!Cas9引入双链DNA断裂,同源介导修复(HDR)就能帮你把转进细胞的同源片段插入切割位点上!4GENOME-SCALEGENOME-
10、SCALEApplicationsKnockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRigDNAgDNA设计设计克隆构建克隆构建病毒包装病毒包装目的细胞系的目的细胞系的感染感染/转染转染KO KO 效率鉴定效率鉴定相关文献:Genome-Scale CRISPR-Cas9 KnockoutScreening in Human Cells(Science 2014)Genome-scale transcriptionalactivation by an engineered CRISPR-Cas9 complex 基因组规
11、模5CRISPRiCRISPRiApplicationsKnockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRigDNAgDNA设计设计克隆构建克隆构建病毒包装病毒包装目的细胞系的目的细胞系的感染感染/转染转染KO KO 效率鉴定效率鉴定图片来源:http:/ 构建癌症疾病动物模型你可以用它研究抑癌基因、耐药基因、致癌基因让你成为癌症研究的佼佼者。CRISPR&CAR-T基因编辑、免疫疗法与癌症之间的“三角关系”http:/ 基因编辑技术及张锋的贡献)http:/ P,Lander E,Zhang F.Developmen
12、t and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome EngineeringJ.Cell,2014,157(6):1262-78.5.Nishimasu H,Ran F A,Hsu P,et al.Crystal Structure of Cas9 in Complex with Guide RNA and Target DNAJ.Cell,2014,156(5):935-49.6.Konermann S,Brigham M D,Trevino A E,et al.Genome-scale transcriptional activation by an e
13、ngineered CRISPR-Cas9 complexJ.Nature,2015,517(7536):583-8.7.Shalem O;Sanjana NE;Hartenian E;Shi X;Scott DA;Mikkelsen TS;Heckl D;Ebert BL;Root DE;Doench JG;Zhang F.Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.J.Science,2014,343(6166):84-87.8.Snchez-Rivera F J,Jacks T.Applications of the CRISPR-Cas9 system in cancer biologyJ.Nature Reviews Cancer,2015,15(7):387-95.1111关注生命科学领域的你PPT借鉴:利兄(营销新人)李益达(逼格PPT)实验流程整理:冰糖CRISPR技术,这个伟大的发明此此课件件下载可自行编辑修改,仅供供参考!感谢您您的支持持,我们努力做得更努力做得更好!谢谢!
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