基因工程载体-噬菌体载体.ppt
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1、2012.09第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体 2噬菌体载体噬菌体载体(phage vectors)一、一、噬菌体载体噬菌体载体二、单链噬菌体载体二、单链噬菌体载体三、噬菌粒载体三、噬菌粒载体四、柯斯质粒载体四、柯斯质粒载体一、一、噬菌体载体噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒(噬菌体是一类细菌病毒(Bacteriophage)(一)噬菌体的一般特性(一)噬菌体的一般特性结构:结构:蛋白质外壳内包裹蛋白质外壳内包裹着着DNA(双链、单(双链、单链、线性、环状等)链、线性、环状等)。T4 Bacteriophage71.噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性溶菌周期指噬菌体将溶菌周期指噬菌体将DNAD
2、NA注入寄主细胞后很快环化,然后注入寄主细胞后很快环化,然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装,进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装,最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。溶源周期中,注入寄主细胞的噬菌体溶源周期中,注入寄主细胞的噬菌体DNADNA是整合到寄主细是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体菌。在溶源性细菌内存
3、在的整合或非整合的噬菌体DNADNA被被称为原噬菌体。称为原噬菌体。噬菌体噬菌体温和噬菌体,具有溶源生长周期和溶菌生长周期温和噬菌体,具有溶源生长周期和溶菌生长周期烈性噬菌体烈性噬菌体,只具有溶菌生长周期只具有溶菌生长周期分为两种:分为两种:(1 1)溶菌周期:溶菌周期:噬菌体的生活周期噬菌体的生活周期烈性噬菌体(烈性噬菌体(virulent phage)virulent phage)(2 2)溶原周期:溶原周期:感染细菌后,将自己的感染细菌后,将自己的DNADNA整合整合到细菌的染色体到细菌的染色体DNADNA中。形成这中。形成这一过程称为溶源化一过程称为溶源化温和噬菌体(温和噬菌体(tem
4、perate phage)temperate phage)2 2、噬菌体的结构和其核酸类型噬菌体的结构和其核酸类型:结构:结构:无尾部结构的二十面体型、无尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、线状体型线状体型 核酸类型:最常见的是双链线性核酸类型:最常见的是双链线性DNADNA、双链环形双链环形DNADNA、单链环形单链环形DNADNA、单链线形单链线形DNADNA、单链单链RNARNA。3、-DNA的物理图谱的物理图谱 -DNA为线状双链为线状双链DNA分子,两端各有一个分子,两端各有一个12核苷核苷酸的互补单链(粘性末端)酸的互补单链(粘性末端)GGGCGG
5、CGAC CT,CCCGCCGCTGGA,称为,称为cos区,全长区,全长48.5kb。特点是功能相近的基因在基特点是功能相近的基因在基因组中聚集在一起。因组中聚集在一起。噬菌体噬菌体 组成特点组成特点:双链线状双链线状DNADNA分子,分子,全长全长50kb50kb,含含6565个基因,个基因,在其分子两端各含有在其分子两端各含有1212个碱基的互补单链,是个碱基的互补单链,是天然的粘性末端,被称为天然的粘性末端,被称为COSCOS位点。位点。噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长 溶菌性生长(溶菌性生长(lytic pathwaylytic pat
6、hway)噬噬菌菌体体感感染染细细菌菌后后,借借助助其其2 2个个COSCOS位位点点互互补补成成环环,在在宿宿主主菌菌体体内内连连续续复复制制,合合成成大大量量基基因因产产物物,进进而而装装配配成成噬噬菌菌体体颗粒,裂解宿主菌,释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。颗粒,裂解宿主菌,释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。溶源性生长溶源性生长(lysogenic pathway)(lysogenic pathway)噬噬菌菌体体感感染染细细菌菌后后,可可将将自自身身DNADNA整整合合到到细细菌菌的的染染色色体体中中去去,与与之之一一起起复复制制,并并遗遗传传给给子子代代细细胞胞,宿宿主主细细胞胞不不
7、被被裂裂解解 。噬菌体 A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR 结构区 重组区重组区调控区裂解区cos位点位点 cos 位点位点ARAREcoRI目的基因EcoRIEcoRI插入型置换型A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII NCOS COS 头部基因头部基因 尾部基因尾部基因 功能不明区功能不明区 溶源化溶源化 重组重组 早期控制早期控制 阻遏阻遏 DNA DNA合成合成 溶菌溶菌生长非必须区段生长非必须区段cI cI基因:溶源过
8、程控制基因。基因:溶源过程控制基因。噬菌体的基因组结构噬菌体的基因组结构5-CGGGGCGGCGACCTCG-33-GCCCCGCCGCTGGAGC-5 Cleavage Ligation(during packaging)(after infection)GGGCGGGCGACCTCG-35-CG +GC-53-GCCCCGCCGCTGGAThe phage cos endsCircular form Linear form(二)(二)噬菌体载体的主要类型噬菌体载体的主要类型 (1)插入式载体插入式载体 一种只具有一个可供外源一种只具有一个可供外源DNADNA插入的克隆位点的插入的克隆位点的
9、 派生载体。派生载体。(2 2)替换型载体(取代型载体)替换型载体(取代型载体)具有成对的克隆位点,在这具有成对的克隆位点,在这 两个位点之间的两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的区段可以被外源插入的DNA片段所取代。片段所取代。(3 3)凯伦噬菌体载体凯伦噬菌体载体(2 2)替换型载体(取代型替换型载体(取代型载体)载体)外源外源DNADNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段的感染和复制非必要的片段 (20 kb 20 kb)高感染效率高感染效率 (10(109 9 转化株转化株/ugug 载体载体 DNA,DNA,比质比质粒高粒高100-1
10、00-倍倍)e.g.EMBL3,DASH替换式载体替换式载体 野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的,外源DNA可以取代这一片段,例如Charon 4A、EMBL 3/4、Charon40等载体,这些载体是用Lac 5(乳糖操纵子的大部分系列,包括完整的Lac Z)替换入噬菌体的中间区段,同时将Lac 5作为选择标记,使用时用EcoRI水解,去掉中间的片段,再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后,感染E.coli使之在E.coli内繁殖,并裂解E.coli,形成空斑。换型噬菌体是使用最广泛的载体。(3 3)凯伦噬菌体载体)凯伦噬菌体载体既有插入型;又有替换型既有插入型;又有
11、替换型在基因工程实验中的用途十分广泛在基因工程实验中的用途十分广泛承受外源承受外源DNADNA的能力:几个的能力:几个kbkb到到23kb23kb(左右臂连接)(三段自身连接)(插入片段)(三)体外包装(三)体外包装 噬菌体噬菌体DNADNA体外重组后,一般必须经体外重组后,一般必须经过体外包装,然后以噬菌体感染的方式将过体外包装,然后以噬菌体感染的方式将重组重组DNADNA导入导入E.coliE.coli细胞内。这是因为以感细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达染方式导入细胞的频率可达10106 610108 8/gDNA/gDNA,而以转染,而以转染(translationtrans
12、lation)的方式导入的频率仅为)的方式导入的频率仅为10103 310105 5/gDNA/gDNA。噬菌体的包装限制为野生噬菌体噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNADNA(约(约48.5 kb48.5 kb)的)的75%105%75%105%。由于由于噬菌体包装时,当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时,噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA(48.5KB)的75%105%左右的,要求载体DNA和外源DNA长度之和在3953kb之间。插入式载体可携带的外源片段较替换式为小。噬菌体载体可接受噬菌体载体可接受15 kb-23 kb的外源的外源DNA片段,它既可作为克隆载体
13、,也可作片段,它既可作为克隆载体,也可作为表达载体,广泛用于各类基因库的构建。为表达载体,广泛用于各类基因库的构建。筛选标记:筛选标记:蓝白斑蓝白斑(LacZ)、噬菌斑噬菌斑等等。1.重组噬菌体重组噬菌体的分子量必须在的分子量必须在野生型噬野生型噬 菌体菌体 分子量大小的分子量大小的75%至至105%之间。之间。用途:用途:b.用于构建基因组或用于构建基因组或cDNA文库。文库。c.用于抗体库或随机肽库的构建。用于抗体库或随机肽库的构建。a.用作一般的克隆载体。用作一般的克隆载体。(四)(四)-DNA的抽提的抽提 1)大肠杆菌培养至对数生长期大肠杆菌培养至对数生长期2)2)加入加入-噬菌体或重
14、组噬菌体或重组-噬菌体悬浮液,噬菌体悬浮液,37培养培养1hr3)3)用新鲜培养稀释,继续培养用新鲜培养稀释,继续培养4-12hr4)4)高速离心,沉淀噬菌体高速离心,沉淀噬菌体5)5)苯酚抽提,释放苯酚抽提,释放-DNA6)6)乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀DNA(五)(五)-DNA作为载体的优点作为载体的优点 1)体外包装病毒颗粒,高效感染体外包装病毒颗粒,高效感染E.coli2)2)装载外源能力为装载外源能力为25kb,大于质粒,大于质粒3)3)筛选方便筛选方便4)4)重组重组-DNA分子提取容易分子提取容易 二、二、单链噬菌体载体单链噬菌体载体(一)(一)单链噬菌体载体单链噬菌体载体
15、M13、f1、fd 噬菌体噬菌体单链环状单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体:的丝状大肠杆菌噬菌体:M13 噬菌体噬菌体单链DNA噬菌体载体M13、f1、fd。优越性:1.单链DNA噬菌体的复制,是以双链环形的DNA为媒介的,这种复制形式 的 DNA简称RFDNA;2.不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌;3.单链DNA噬菌体颗粒的大小,是受其DNA的多制约的,不存在包装限制 问题;4.容易测定外源DNA片断的插入取向;5.可产生含外源片断的单链DNA分子。3.M13噬菌体噬菌体 噬菌体噬菌体正链正链复制复制复制型复制型DNA经经pII蛋白蛋白造缺口造缺口35经经pII蛋白蛋白剪切剪切
16、释出单链释出单链DNA(正链正链)进入下进入下一循环一循环5335滚环复制滚环复制在细菌内的复制模式图在细菌内的复制模式图 M13噬菌体几个重要特点噬菌体几个重要特点:1.M13噬菌体噬菌体不溶解不溶解宿主细胞,只是宿主细胞,只是降降 低低宿主细胞的生长速度。宿主细胞的生长速度。2.M13噬菌体能以噬菌体能以单链单链和和双链双链两种方式两种方式存在,因此可以用存在,因此可以用感染感染(经包装的单经包装的单链链DNA)和和转化转化(双链双链DNA)。3.克隆的外源基因片段不宜大于克隆的外源基因片段不宜大于1000bp。M13M13噬菌体载体噬菌体载体 M13 M13是一种含单键(是一种含单键(+
17、)DNADNA(ssDNAssDNA)的)的丝状大肠杆菌噬菌体,其基因组大小为丝状大肠杆菌噬菌体,其基因组大小为6.4kb6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链片段,这类载体主要用来获得大量的单链片段,这种单链片段在遗传学研究中主要用来这种单链片段在遗传学研究中主要用来测定序列(测定序列(sangersanger双脱氧法)、基因的双脱氧法)、基因的定点突变研究、异源双链定点突变研究、异源双链DNADNA的分析等。的分析等。M13M13噬菌体的特点噬菌体的特点感染Ecoli后,在宿主细胞内会形成双链的复制型(replication form DNA,RF DNA)。可以象质粒那样在体外进行纯
18、化和操作。成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞,这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RF DNA或ss DNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。噬菌体颗粒的大小是受其的大小制约的,这一点正好与噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。M13M13单链单链DNADNA噬菌噬菌体的生命体的生命周期周期RF DNAPhage M13 replication in the host cell:+RNA polDNA polIIIRFNicked by gene 2 protein+ss-Rolling circle replication,then cut and
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