色谱聚焦亲和色谱.ppt
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1、第六章色谱(层析)聚焦Chromatofocusing第一节概述据生物分子pI的不同,在动相中动速不同进行分离(适于水溶性的两性分子)特点:.自动形成pH梯度,不需特殊实验装置;.蛋白质聚焦自身pIpH单位,分辨率很高。第三节 PB与PBE一、PB(polybuffer)-多组分缓冲液为分子量不同的多羧基多氨基化合物(两性电解质性缓冲剂)特点:.I不高,但缓冲力强;.缓冲能力是均匀的。二、PBE(polybuffer exchange)PBE(polybuffer exchange)多缓冲交换剂多缓冲交换剂以交联琼脂糖Sepharose CL-6B为基质,并在糖上通过醚键偶合上配基而成 如低聚
2、乙烯亚胺要求:确保很宽的pH范围有均衡的缓冲容量。第四节第四节 实验要点实验要点步骤样品pI的查阅或测定选PBE,PB和起始缓冲液装柱,平衡安装仪器(增pH计)加PB少量入柱加样加PB洗脱 再生 PBE 洗脱液 脱PB一、PBE,PB和起始缓冲液的选择.查pI或测定.由pI确定pH梯度范围 最大范围 33.5为提高Rs,选择的pH范围应含要分离样品pI,并使其有2/31/2的柱长的吸附解吸时间。.由产品性能表选择.PBE94.选始缓冲液pH9.4,乙醇胺-HAC (0.025).选PB96 用HCl调pH7.0二、装柱.PBE量由样品量确定PBE量一般100mgpr/10ml床体积、每pH单位
3、 .柱选择H/D=3060.充填(同前).平衡 用始缓平衡,要求:.缓冲液使用前应先脱气,以除去其中CO2.需平衡到进出液pH、I、电导都一样。.校验 柱装好坏,用有色的牛细胞色素C检查。三、样品.VS因聚焦浓缩效应,VS最大可达50%2Vt但最好0.5Vt.I0.05.加样要求:.上样前应先加5mlPB,以免 .需使样品均匀平整加在床面上 四、洗脱.洗脱剂用量 pH 取决于洗脱剂浓度 梯度 浓度大,峰间距小 范围 浓度小,峰宽大 梯度体积 一般:1213Vt.流速一般线速在3040cm/hr.检测主要是目的物浓度、pH五、PB的除去1.沉淀法:加硫铵,再透析 2.凝胶过滤:常用Sephade
4、xG-75 六、再生 一般:.先除去吸附的杂质 对pI6,在柱顶,可用1mol/LNaCl 对pI很小,可用0.1mol/LHCl .用起始缓冲液平衡七、保存 24%乙醇八、结果讨论.顶替(取代)效应 带电量除与pI有关,还与滴定曲线有关,B在pH更高才被吸附(如下图所示)静静电电荷荷+-ABpHpH洗脱洗脱VIIpH 后期I的增加 出现竞争性结合 影响B类分子的吸附 造成B类分子提前洗脱.陶南效应(阴陶南效应(阴IEIE)因表观pI下降,出现滞后洗脱。.溶解度溶解度造成滞后洗脱因pH pI时S,往往需更低pH时,其S,才被洗出。第五节第五节 技术的应用技术的应用1.蛋白质类(包括酶)的分离2
5、.蛋白质类(包括酶)等电点测定3.P175-177第七章第七章 亲和色谱亲和色谱 Affinity Chromatography,ACAffinity Chromatography,AC 第一节 概述原理 利用生物体中许多高分子化合物具有和某些相对应的分子可逆结合的特性建立的色谱法。一、特点高效、高收率、有浓缩效应,使用局限性 二、应用高效从复杂混合物中得某一种物质;基于生物功能可把有活性与无活性分开三、基本过程 须找配基(它与底物专一可逆结合如下图)亲和层析法的作用原理示意说明:1.偶联用Gel(须是活化偶联介质)2.亲和吸附剂 高度专一亲和吸附剂 类专一亲和吸附剂3.按相互作用力划分:次级
6、键亲和色谱配位键螯合色谱共价键共价色谱疏水键疏水色谱亲和层析的必要条件:z 合适的配体(配基、ligand)z 合适的载体(Matrix)z 合适的吸附和洗脱条件第二节 亲和色谱配基(ligandL)作为配体的条件 亲和力大;具有解离平衡;与载体偶联不失活常用系统酶:底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物核酸:互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物激素:受体、运载蛋白抗体:抗原、病毒、细胞外源凝集素:多糖、糖蛋白、细胞 配体的浓度z 一般使用较高的固定化配体浓度一般使用较高的固定化配体浓度z 配体亲和力高,且本身带电则浓度须降低配体亲和力高,且本身带电则浓度须降低z 配体浓度过高引起色谱畸
7、变。配体浓度过高引起色谱畸变。(与很多物质发生与很多物质发生非特异性结合非特异性结合)配体的选择配体的选择1.考虑亲和势L+SLSKl=LS/LS要求Kl在10-410-8mol/L之间2.与L的偶联不破坏L与S的结合3.需了解L-S的作用机制 如 z例:酶例:酶 有单底物反应、双底物反应有单底物反应、双底物反应z单单 A P E E EA EP 底物A、产物P或它们的类似物都可以双底物依次双底物依次z A B P Q E E EA EAB EPQ EQ 须选择A、若选B则吸附时须加A双底物随机双底物随机z A(B)B(A)P(Q)Q(P)E E EA EA(B)EPQ A、B都可选择 对A、
8、B的选择仅取决于它们亲和势的大小和固定化的难易程度。第三节第三节 亲和层析载体亲和层析载体一、作为载体的条件一、作为载体的条件 1.亲水 2.惰性 3.具有活化基团 4.大网孔 5.机械性能好二、载体的选择二、载体的选择 1.琼脂糖凝胶:亲水性强,理化性质稳定 (商品名:Sepharose)2.聚丙烯酰胺凝胶:理化性质稳定,耐有机溶剂及去污剂,抗微生物能力强,特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。3.葡聚糖凝胶:有良好的化学及物理性质,孔径小。4.纤维素:非特异吸附严重,廉价,易得。5.多孔玻璃:物理性能好,有非特异性吸附。三、手臂(Spacerarm)在载体和配基间引入适当长度的“手臂”
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