酶活性的测定.pptx
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1、会计学1酶活性的测定酶活性的测定二、材料和设备二、材料和设备、材料、材料、材料、材料 :马铃薯块茎:马铃薯块茎:马铃薯块茎:马铃薯块茎 、仪器设备:、仪器设备:、仪器设备:、仪器设备:751 751 751 751 型分光光度计、离心机、研钵、型分光光度计、离心机、研钵、型分光光度计、离心机、研钵、型分光光度计、离心机、研钵、25ml 25ml 25ml 25ml 容量容量容量容量瓶、量筒、试管、吸量管。瓶、量筒、试管、吸量管。瓶、量筒、试管、吸量管。瓶、量筒、试管、吸量管。、试剂:、试剂:、试剂:、试剂:0.05ml/L0.05ml/L0.05ml/L0.05ml/L愈创木酚溶液,愈创木酚溶
2、液,愈创木酚溶液,愈创木酚溶液,0.05ml/L0.05ml/L0.05ml/L0.05ml/L的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液(pH5.5)(pH5.5)(pH5.5)(pH5.5),2%H2%H2%H2%H2 2 2 2O O O O2 2 2 2,0.1mol/L0.1mol/L0.1mol/L0.1mol/L儿茶酚溶液,儿茶酚溶液,儿茶酚溶液,儿茶酚溶液,20%20%20%20%三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液第1页/共30页三、实验步骤三、实验步骤三、实验步骤三、实验步骤、酶液的制备、酶液的制备、酶液的制备、酶液的制备取取5.0g5.0g洗净去皮的马铃
3、薯块茎,洗净去皮的马铃薯块茎,切碎,放入研钵中。加适量的切碎,放入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中,于浆液全部转入离心管中,于3000g3000g水中离心水中离心10min10min,上清液,上清液转入转入25ml 25ml 容量瓶中。沉淀用容量瓶中。沉淀用5ml5ml磷酸缓冲液再提取次,上磷酸缓冲液再提取次,上清液并入容量瓶中,定容至刻清液并入容量瓶中,定容至刻度,低温下保存备用。度,低温下保存备用。第2页/共30页、过氧化物酶活性的测定、过氧化物酶活性的测定 酶活性测定的反应体系包括酶活性测定的反应体系包括:2.9ml 0.05mol
4、/L:2.9ml 0.05mol/L磷酸缓冲磷酸缓冲液、液、1.0ml 2%H1.0ml 2%H2 2O O2 2、1.0ml 1.0ml 0.05mol/L 0.05mol/L 愈创木酚和愈创木酚和0.1ml0.1ml酶酶液。液。以在沸水中加热以在沸水中加热5min5min的酶液为对照,做二组重复实的酶液为对照,做二组重复实验。反应体系加入酶液后,立验。反应体系加入酶液后,立即于即于3737水浴中保温水浴中保温15min15min,然,然后迅速转入冰浴中,并加入后迅速转入冰浴中,并加入2.0ml 20%2.0ml 20%三氯乙酸终止反应。三氯乙酸终止反应。然后,过滤然后,过滤(或或5000g
5、 5000g 离心离心10min),10min),滤液适当稀释,用滤液适当稀释,用751751型分光光度计在型分光光度计在470nm470nm波长下测波长下测定反应体系的吸光度。定反应体系的吸光度。第3页/共30页四、实验结果四、实验结果四、实验结果四、实验结果 以每以每以每以每minminminmin内内内内A A A A470470470470变化变化变化变化0.010.010.010.01为为为为1 1 1 1个过氧化物酶活力单位个过氧化物酶活力单位个过氧化物酶活力单位个过氧化物酶活力单位 酶活力酶活力酶活力酶活力=D=D=D=D 酶的比活力酶的比活力酶的比活力酶的比活力=D=D=D=D
6、 式中,式中,式中,式中,A A A A为反应时间内吸光度的变化;为反应时间内吸光度的变化;为反应时间内吸光度的变化;为反应时间内吸光度的变化;W W W W为马铃为马铃为马铃为马铃薯鲜重(薯鲜重(薯鲜重(薯鲜重(g g g g););););t t t t为反应时间(为反应时间(为反应时间(为反应时间(minminminmin););););D D D D为稀释倍数,为稀释倍数,为稀释倍数,为稀释倍数,即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数A0.01tA0.01Wt第4页/共30页CAT
7、CAT过氧化氢酶活性测定过氧化氢酶活性测定方法方法第5页/共30页 过氧化氢酶过氧化氢酶(Hydrogen(Hydrogen Peroxidase)Peroxidase)又名触酶又名触酶(Catalase(Catalase,CAT)CAT),是一类以铁,是一类以铁卟琳为辅基的结合酶,由卟琳为辅基的结合酶,由4 4个亚个亚基组成,分子量为基组成,分子量为240 000240 000。存。存在于动植物组织与细胞中的氧在于动植物组织与细胞中的氧化还原酶类,它专一性地将细化还原酶类,它专一性地将细胞代谢产生的过氧化氢分解成胞代谢产生的过氧化氢分解成H H2 2O O和和0 02 2,避免了,避免了H
8、H2 20 02 2在体内积累,在体内积累,从而可维持体内正常的活性氧从而可维持体内正常的活性氧水平。是最早发现的与种子活水平。是最早发现的与种子活力有关的氧化酶类之一力有关的氧化酶类之一.第6页/共30页过氧化氢酶的应用:过氧化氢酶的应用:过氧化氢酶的应用:过氧化氢酶的应用:n n被用于食品包装,防止食物被氧化。被用于食品包装,防止食物被氧化。被用于食品包装,防止食物被氧化。被用于食品包装,防止食物被氧化。n n在纺织工业中,被用于除去纺织物上的过氧化氢,以保证成品是不在纺织工业中,被用于除去纺织物上的过氧化氢,以保证成品是不在纺织工业中,被用于除去纺织物上的过氧化氢,以保证成品是不在纺织工
9、业中,被用于除去纺织物上的过氧化氢,以保证成品是不含过氧化物的。含过氧化物的。含过氧化物的。含过氧化物的。n n它还被用在它还被用在它还被用在它还被用在隐形眼镜隐形眼镜隐形眼镜隐形眼镜的清洁上:眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸的清洁上:眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸的清洁上:眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸的清洁上:眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡后,使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。泡后,使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。泡后,使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。泡后,使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。n n近年来,过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了近年来,
10、过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了近年来,过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了近年来,过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该酶和过氧化氢,目的是增加该酶和过氧化氢,目的是增加该酶和过氧化氢,目的是增加该酶和过氧化氢,目的是增加表皮表皮表皮表皮上层的细胞氧量。上层的细胞氧量。上层的细胞氧量。上层的细胞氧量。n n植物细胞中的过氧化物酶体参与了植物细胞中的过氧化物酶体参与了植物细胞中的过氧化物酶体参与了植物细胞中的过氧化物酶体参与了光呼吸光呼吸光呼吸光呼吸(利用氧气并生成(利用氧气并生成(利用氧气并生成(利用氧气并生成二氧化二氧化二氧化二氧化碳碳碳碳)和
11、共生性氮固定(将)和共生性氮固定(将)和共生性氮固定(将)和共生性氮固定(将氮气氮气氮气氮气(N2(N2(N2(N2)解离为活性氮原子)。细胞被)解离为活性氮原子)。细胞被)解离为活性氮原子)。细胞被)解离为活性氮原子)。细胞被病病病病原体原体原体原体感染时,过氧化氢可以被用作一种有效的抗感染时,过氧化氢可以被用作一种有效的抗感染时,过氧化氢可以被用作一种有效的抗感染时,过氧化氢可以被用作一种有效的抗微生物微生物微生物微生物试剂。试剂。试剂。试剂。n n 其活性也与粮食品质之间有一定的相关性,是一项衡量谷物品质的其活性也与粮食品质之间有一定的相关性,是一项衡量谷物品质的其活性也与粮食品质之间有
12、一定的相关性,是一项衡量谷物品质的其活性也与粮食品质之间有一定的相关性,是一项衡量谷物品质的重要指标。重要指标。重要指标。重要指标。第7页/共30页过氧化氢酶的测定:过氧化氢酶的测定:过氧化氢酶的测定:过氧化氢酶的测定:n n化学测定法:高锰酸钾滴定法,碘量法。化学测定法:高锰酸钾滴定法,碘量法。n n光度法:紫外分光光度法,荧光分析法,化学发光法。光度法:紫外分光光度法,荧光分析法,化学发光法。n n电化学法:极谱氧电极法,电流测定法,电泳一染色法。电化学法:极谱氧电极法,电流测定法,电泳一染色法。n n放射化学测定法。放射化学测定法。n n简易气量测定法。简易气量测定法。第8页/共30页高
13、锰酸钾滴定法高锰酸钾滴定法高锰酸钾滴定法高锰酸钾滴定法:过氧化氢酶(过氧化氢酶(CATCAT)属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧)属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水和分子氧,在此过程中起传递电子的作用,过化氢分解为水和分子氧,在此过程中起传递电子的作用,过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。据此,可根据据此,可根据HH2 2OO2 2的消耗量或的消耗量或OO2 2的生成量测定该酶活力大小。的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量(反应过量)的在反应系统中加入一定量(反应过量)的HH2 2OO2 2溶液,经酶促溶液,经酶促反应后,用标准高锰酸钾溶液
14、(在酸性条件下)滴定多余的反应后,用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的HH2 2OO2 2。n n即可求出消耗的即可求出消耗的HH2 2OO2 2的量。的量。第9页/共30页n n酶活性用每克鲜重样品酶活性用每克鲜重样品酶活性用每克鲜重样品酶活性用每克鲜重样品1min1min1min1min内分解内分解内分解内分解H H H H2 2 2 2O O O O2 2 2 2的毫克数的毫克数的毫克数的毫克数表示:表示:表示:表示:n n 酶活酶活酶活酶活(mgH(mgH(mgH(mgH2 2 2 2O O O O2 2 2 2/gFWmin)=/gFWmin)=/gFWmin)=/gFWmi
15、n)=n n式中式中式中式中 A A A A对照对照对照对照KMnOKMnOKMnOKMnO4 4 4 4滴定毫升数;滴定毫升数;滴定毫升数;滴定毫升数;n n B B B B酶反应后酶反应后酶反应后酶反应后KMnOKMnOKMnOKMnO4 4 4 4滴定毫升数;滴定毫升数;滴定毫升数;滴定毫升数;n n V V V VT T T T酶液总量(酶液总量(酶液总量(酶液总量(mlmlmlml););););n n V V V V1 1 1 1反应所用酶液量(反应所用酶液量(反应所用酶液量(反应所用酶液量(mlmlmlml);n n W W W W样品鲜重(样品鲜重(样品鲜重(样品鲜重(g g
16、g g););););n n 1.71ml 0.1mol/L 1.71ml 0.1mol/L 1.71ml 0.1mol/L 1.71ml 0.1mol/L的的的的KMnOKMnOKMnOKMnO4 4 4 4相当于相当于相当于相当于1.7mg H1.7mg H1.7mg H1.7mg H2 2 2 2O O O O2 2 2 2。第10页/共30页 n n紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法:n nH H H H2 2 2 2O O O O2 2 2 2在在在在240nm240nm240nm240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解
17、过氧波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度化氢,使反应溶液吸光度化氢,使反应溶液吸光度化氢,使反应溶液吸光度(A(A(A(A240240240240)随反应时间而降低。根据随反应时间而降低。根据随反应时间而降低。根据随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。n n 以以以以1min1min1min1min内内内内A A A A240240240240减少减少减少减少0.10
18、.10.10.1的酶量为的酶量为的酶量为的酶量为1 1 1 1个酶活单位(个酶活单位(个酶活单位(个酶活单位(u u u u)。)。)。)。n n n n 过氧化氢酶活性过氧化氢酶活性过氧化氢酶活性过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=(u/gFW/min)=(u/gFW/min)=(u/gFW/min)=n n式中式中式中式中 A A A A240 240 240 240=A=A=A=AS0S0S0S0 n n A A A AS0S0S0S0加入煮死酶液的对照管吸光值;加入煮死酶液的对照管吸光值;加入煮死酶液的对照管吸光值;加入煮死酶液的对照管吸光值;n n A A A AS1S1S1S1,
19、A,A,A,AS2S2S2S2样品管吸光值;样品管吸光值;样品管吸光值;样品管吸光值;n n Vt Vt Vt Vt粗酶提取液总体积(粗酶提取液总体积(粗酶提取液总体积(粗酶提取液总体积(mlmlmlml););););n n V V V V1 1 1 1测定用粗酶液体积(测定用粗酶液体积(测定用粗酶液体积(测定用粗酶液体积(mlmlmlml););););n n FW FW FW FW样品鲜重(样品鲜重(样品鲜重(样品鲜重(g g g g););););n n 0.1A 0.1A 0.1A 0.1A240240240240每下降每下降每下降每下降0.10.10.10.1为为为为1 1 1 1
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