小麦普通腥黑穗病菌分子检测.doc
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1、ICS 65.020.01B 16DB37山东省 地方标准DB 37/T 36302019小麦普通腥黑穗病菌分子检测方法Molecular detection methods of Tilletia foetida & Tilletia caries2019 - 07 - 23 发布2019 - 08 - 23 实施山东省市场监督管理局 发 布DB37/T 36302019I目 次前言.II1 范围.12 术语和定义.13 仪器设备.14 主要试剂.15 分子检测.15.1 小麦种子中小麦普通腥黑穗病菌冬孢子基因组 DNA 提取.1 5.2 菌瘿中冬孢子基因组 DNA 提取.2 5.3 引物序
2、列.2 5.4 PCR 扩增 .2 5.5 电泳检测.2 5.6 检测结果判断.36 结果判定.37 样品保存.38 档案保存.3DB37/T 36302019II前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:山东省植物保护总站、山东农业大学。 本标准主要起草人:于金凤、刘存辉、商明清、孙晓凤、杨勤民、金扬秀、李洪刚、张德满、张 莉、谢传峰、徐鲁、成文华。DB37/T 363020191小麦普通腥黑穗病菌分子检测方法1 范围本标准规定了小麦普通腥黑穗病菌的分子检测方法。 本标准适用于
3、小麦普通腥黑穗病菌的分子检测。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1 小麦普通腥黑穗病菌 Tilletia foetida & Tilletia caries 指引起小麦普通腥黑穗病的病原菌统称,包括小麦光腥黑穗病菌(Tilletia foetida)和小麦网腥黑 穗病菌(Tilletia caries)两种。2.2 小麦普通腥黑穗病菌分子检测 Molecular detection of Tilletia foetida & Tilletia caries 指依据小麦光腥黑穗病菌(Tilletia foetida)和网腥黑穗病菌(Tilletia caries)的ITS序列,设计特
4、 异性引物,经PCR扩增获得特异性片段,依据特异性片段的有无进行判断检测。3 仪器设备摇床、显微镜、普通离心机、电热恒温水浴锅、移液器、超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像 系统、锥形瓶、离心管、盖玻片、载玻片、电子天平等。4 主要试剂除特别说明外,本标准所用试剂均为分析纯。 CTAB缓冲液、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、TE 缓冲液、PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA marker、1TAE 缓冲液、琼脂糖、DNA Loading 缓冲液、溴化乙锭、3 mol/L NaOH 溶液、1 mol/L HCl 溶液等。5 分子检测5.1 小麦种子中小麦普通腥黑穗
5、病菌冬孢子基因组 DNA 提取5.1.1 称取 50 g 小麦种子放入 250 mL 锥形瓶中,加入 100 mL 无菌去离子水,试验重复 3 次。 5.1.2 摇床 200 rpm 振荡 5 min 后,静置 10 min。收集洗涤悬浮液于 100 mL 离心管,8 000 rpm 离 心 10 min,弃上清,留沉淀。DB37/T 3630201925.1.3 加入 1.5 mL 无菌水,充分混匀,转至 2 mL 离心管中,10 000 rpm 离心 5 min,弃上清。 5.1.4 用 1 mL 无菌水冲洗 100 mL 离心管 2 次,洗涤液一并转移至 2 mL 离心管,10 000
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