根癌农杆菌介导法-植物基因工程教学课件.ppt
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1、植物基因工程根癌农杆菌介导法农杆菌l 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状根。原理l 根癌农杆菌的细胞内有一个大的致瘤质粒,简称Ti质粒,其上有一段T-DNA,农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中。l 因此,农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系,改造的Ti质粒就是一个优良的植物转基因载体。Ti质粒结构特点l 转移到植物基因组中的DNA序列,与肿瘤形相关。l 激活T-DNA的转移,使植物致瘤,是毒性区。l 调控Ti质粒在根癌农杆菌之间的转移,是接合转移编码区。l 调控Ti质粒的自我
2、复制,为复制起始区。Ti-质粒的基因结构T-DNA区(transferred DNA region)Vir区(virulence region)Con区(region encoding conjugation)Ori区(origin of replication)一元载体(卸甲载体)1.切除T-DNA中的致瘤基因,仅保留两侧边界与T-DNA准确转移所需的25个碱基序列。2.在T-DNA区中删除致瘤基因位点插入与中间载体同源的质粒序列。3.用特定转移方法转移中间载体,发生同源重组。4.根据中间载体所携带的抗性基因进行筛选。5.用筛选后的菌株侵染植物组织细胞。二元载体l基本原理:T-DNA区与Vi
3、r区不在同一个载体上,Vir区通过反式作用使T-DNA区发生转移。微型Ti质粒l根癌农杆菌 辅助Ti质粒l外源基因 微型Ti质粒 含有辅助Ti质粒的根癌农杆菌 植物缺失Vir,T-DNA卸甲,引入酶切位点去掉T-DNA去T-DNA导入植物基因组的过程一、农杆菌对受体的识别 菌株对植物细胞所释放的化学物质产生趋向性。二、农杆菌附着到受体细胞 创伤部位生存了816h(细胞调节期)的菌株才能诱发肿瘤。期间,农杆菌产生纤丝将自身缚附在植物细胞壁表面。影响T-DNA转移的因素l 农杆菌菌株菌株侵染力:农杆碱型菌株胭脂碱型菌株章鱼碱型菌株l 农杆菌菌株高侵染活力的生长时期一般用0.31.0OD农杆菌菌液接种植物材料l外植体的预培养一般为23天作用:促进细胞分裂;使外植体适应于试管立体培养的条件;有利于外植体能与培养基平整接触。l外植体的接种及培养一般接种时间130min 接种菌液浓度0.31.5OD
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