核酸世界—DNA与RNA的王朝.ppt

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1、核酸世界核酸世界DNA与与RNA的王朝的王朝朱德裕联系方式姓名：朱德裕手机：15254189218Email：QQ号：1419042523 （不常用）单位：生命科学学院微生物技术国家重点实验室专业：生物化学与分子生物学从事研究方向：蛋白质结构与功能研究课程目的1.了解核酸生物化学的基本知识、理论，介绍本学科的学术前沿；2.培养、提高科研兴趣，启发创新精神；3.希望，最起码对你们对分子生物学课程的理解有所帮助，期望，有益于你们从事科研工作。v1.核酸生物化学（李冠一等编著）v2.TheRNAworld,ThirdEditionv3.NucleicAcidsResearch（杂志）使用教材及主要参

2、考书科普的态度讲述基础内容，适当引入最新进展，并进以探讨。课程内容采用专题综述的方式，关注当前热点研究。以实用性为主，介绍相关的实验操作,同时尽量使用整合的视频，力争趣味性。讲课方式第一讲第一讲 核酸概述核酸概述讨论人常见的遗传现象讨论人常见的遗传现象主要发现：一项原则（显性原则）和两项基本定律（分离定律和自由组合定律）。孟德尔（GregorJohannMendel，18221884）生于奥地利，神职人员，遗传学的奠基人。区分外形区分外形 豌豆有高茎和矮茎并且由此入手。显性法则的发现显性法则的发现 将高茎种子培育成的植株的花朵上，受以矮茎种子培育成的植株的花粉。与此相反，在矮茎植株的花朵上受以

3、高茎植株的花粉。两者培育出来的下一代都是高茎品种。分离定律的发现分离定律的发现 接下来将这批高茎品种的种子再进行培植，第二年收获的植株中，高矮茎均有出现，高茎:矮茎两者比例约为3:1。约从1856年到1863年，他进行了8年的豌豆杂交杂交实验。具有相对性状的亲本P1（含基因对AA）和P2（含基因对aa）产生的子代第一代仅表现P1的性状；子代第二代既有P1的也有P2的性状，并且出现P1与P2性状的比例为3:1。基因的连锁和交换定律：基因的连锁和交换定律：位于同一条染色体上的不同基因，常常连在一起进入配子；位于同源染色体上的等位基因有时会发生交换，因而产生了基因的重组。v灰身长翅果蝇的灰身基因和长

4、翅基因位灰身长翅果蝇的灰身基因和长翅基因位于于 上，以上，以()表示。表示。v黑身残翅果蝇的黑身基因和残翅基因位黑身残翅果蝇的黑身基因和残翅基因位于于 上，以上，以()表示。表示。B V b vv经过杂交，经过杂交，F1是灰身长翅，其基因型是是灰身长翅，其基因型是()。B V b v同一染色体同一染色体同一染色体同一染色体摩尔根（Thomas.Hunt.Morgan,18661945)F1测交测交PBVbvBV纯种灰身纯种灰身长翅长翅bv纯种黑身纯种黑身残翅残翅BVbvbvBV灰身长翅灰身长翅雄雄bvbv黑身残翅黑身残翅雌雌BVbvbv配子配子配子配子测交测交后代后代BVbvbvbv灰身长翅灰

5、身长翅50%黑身残翅黑身残翅50%F1测交测交 雌雌BVbvBvbVbvbv雄雄bvBVbvBvbVBVbvbvbvBvbvbVbv灰身长翅灰身长翅黑身长翅黑身长翅8.5%灰身长翅灰身长翅41.5%黑身残翅黑身残翅41.5%纯种黑身纯种黑身残翅残翅灰身残翅灰身残翅8.5%弗雷德里希弗雷德里希米歇尔米歇尔，1844年8月13日1895年8月26日），瑞士生物学家遗传因子是不是一种物质实体？早在1868年，一个瑞士研究生名叫米歇尔就发现了核酸。米歇尔为了索取大量的实验材料，标新立异地收取了大量又脏又臭的外科手术绷带，仔细地用稀的硫酸钠溶液洗涤绷带，使白细胞几乎完全无损地与脓液中血清及其他物质分开。

6、并用胃蛋白酶进行分解，结果发现细胞遗体的大部分被分解了，但对细胞核不起作用。在当时，能够把细胞核用化学方法提取出来的，整个世界只有米歇尔一人。核酸的发现核酸的发现当米歇尔用碱溶液继续处理细胞核时，竟发现了一种前所未见的化合物，既不溶解于水、醋酸，也不溶解于稀盐酸和食盐溶液的未知的新物质，进一步分析，该物质种富含磷和氮。于是便给这种从细胞核中分离出来的物质取名为“核素”，就是我们现在所指的核蛋白。20年后，即1889年，生物化学家奥尔尔特曼（Altrmann）从酵母和动植物组织中终于制备出纯净的、不含蛋白质的细胞核中的酸性物质，将其称为核酸核酸。此时的米歇尔已45岁，正在故乡巴塞尔尔的莱茵河畔，

7、已接近了核酸的分离最后阶段，他发现“核素”中的一部分是大分子组成的酸性基因,实际上他那种酸性基因就是核酸。但大度无私的米米歇尔承认了奥尔尔特曼的科研成果，认为他把“核素”研究大大地推进了一步.讨论对核酸发现的历史20世纪初，德国科赛尔（与米歇尔同是霍佩塞勒的学生，1853-1927）和他的两个学生琼斯（1865-1935）和列文（18691940）的研究，弄清了核酸的基本化学结构，认为它是由许多核苷酸组成的大分子。核苷酸是由碱基、核糖和磷酸构成。其中碱基有4种(腺瞟呤、鸟瞟呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)，核糖有2种(即核糖与脱氧核糖)。核酸的基本结构核酸的基本结构磷酸嘧啶碱(C、U、T)嘌呤碱(A、G

8、)碱基戊糖核苷核苷酸列文急于发表他的研究成果，错误地认为4种碱基在核酸中的量是相等的，从而推导出核酸的基本结构是由4个含不同碱基的核苷酸连接成的四核苷酸，以此为基础聚合成核酸，提出了“四核苷酸假说”。这个错误的假说，对认识复杂的核酸结构起了相当大的阻碍作用。PhoebusAaronTheodoreLevene核酸刚刚闪耀出的光辉被列文无情地抹杀了。按这种假说，核酸的组合形式就很单一，人们认为它的结构太简单，很难设想它能在遗传过程中起什么作用。两种不同的肺炎球菌菌株:有平滑的外膜（S）;没有外膜，外表粗糙（R）。S型又可分成许多不同的小类型，如S、S、S等 美国科学家格里菲斯（1879-1941

9、）1928年，格里菲斯开创性的肺炎双球菌实验在加热中，荚膜中的核酸并没有被破坏这一实验结果可以有三种解释。（1）S细菌可能并未完全杀死。但这种解释不能成立，因为单独注射经过处理的S时并不能致死小家鼠。（2）R型已转变为S型。这一点也不能成立。虽然，R，S两型可以相互转化，但剖检发现的是S不是S，R型从S突变而来，理应转化为 S。（3）R型从杀死的S获得某种物质，导致类型转化，从而恢复了丧失的合成荚膜的能力。格里菲斯肯定了第三种解释。这就是最早发现的转化现象。证明S型小鼠体内含有“转化因子”,可以使R型细菌转化为S型细菌。1944年,艾弗里、柯林麦克劳德和麦克林麦卡的肺炎球菌转化现象证明了遗传的

10、物质基础是核酸。O.T.Avery，1877-1955材料：选用肺炎双球菌。操作：将S型细菌中的多糖、蛋白质、脂类和DNA等提取出来，分别与R 型细菌进行混合结果：只有DNA与R型细菌进行混合，才能使R型细菌转化成S型细菌。结论：DNA是遗传物质。但是，这个发现没有得到广泛的承认，艾弗里转化实验所使用的DNA中仍然含有极少量的蛋白质（0.02%），人们怀疑残留的蛋白质起到转化的作用。journal of Experimental Medicine第79卷第137期噬菌体是以细菌细胞为寄主的一种病毒，主要成分蛋白质和DNA。它像一个小蝌蚪，外部是由蛋白质组成的头膜和尾鞘，头的内部含有DNA，尾鞘

11、上有尾丝、基片和小钩。当噬菌体侵染大肠杆菌时，先把尾部末端扎在细菌的细胞膜上，然后将它体内的DNA全部注人到细菌细胞中去，蛋白质空壳仍留在细菌细胞外面。进入细菌细胞后的噬菌体DNA，就利用细菌内的物质迅速合成噬菌体的DNA和蛋白质，从而复制出许多与原噬菌体大小形状一模一样的新噬菌体，直到细菌被彻底解体，这些噬菌体才离开死菌，再去侵染其他的细菌。1952年赫尔希（A.D.Hershey）等噬菌体侵染细菌的实验肯定了DNA是遗传物质 蛋白质：C，H，O，N,SDNA，C，H，O，N，P放射性同位素35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质和DNA（35S标记蛋白质；32P标记DNA）结果噬菌体将带3

12、5S标记的空壳留在大肠杆菌外面，带有32P标记的核酸全部注入大肠杆菌，并在大肠杆菌内成功地进行噬菌体的繁殖。在19481952年4年时间内，经过多次反复实验，终于得出了不同于列文的结果。实验结果表明，在DNA大分子中嘌呤和嘧啶的总分子数量相等，其中腺嘌呤A与胸腺嘧啶T数量相等，鸟嘌呤G与胞嘧啶C数量相等。说明DNA分子中的碱基A 与T、G与C是配对存在的，从而否定了四核苷酸假说，并为探索DNA分子结构提供了重要的线索和依据。查加夫对碱基含量关系的新发现查加夫对碱基含量关系的新发现奥地利生物化学家查加夫（ErwinChargaff，1905-2002）DNADNA双螺旋结构的分子模型双螺旋结构的

13、分子模型DNA晶体X射线衍射照片JamesWatson，MauriceWilkins，FrancisCrick，RosalindFranklinJames Watson，1928-；Francis Crick，1916-2004。1.两条DNA单链，反向平行，右手螺旋成双链结构。2.外部是磷酸和脱氧核糖交替构成的内部碱基遵循碱基互补配对原则（A-T,C-G）3.碱基之间是由氢键连接脱氧核苷酸之间由磷酸二脂键链接。讨论讨论 DNA双螺旋结构的发现双螺旋结构的发现蛋白质外壳蛋白质外壳蛋白质外壳蛋白质外壳RNARNA无感染力无感染力无感染力无感染力有感染力有感染力有感染力有感染力可产生新可产生新可产

14、生新可产生新TMVTMV病病病病毒毒毒毒水和苯酚水和苯酚水和苯酚水和苯酚1 1956956年，年，格勒和施拉姆格勒和施拉姆证明有些病毒的遗传物质是证明有些病毒的遗传物质是RNARNA有些病毒只含有RNA和蛋白质，不含有DNA,称为RNA病毒，又叫做逆转录病毒。如烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)，其遗传物质是RNA。1956年 美籍华裔科学家蒋有兴和瑞典细胞遗传学家阿尔伯特列文确定人类共有23对染色体。美国生物化学家阿瑟科恩伯格分离出DNA聚合酶。1957年 美国科学家弗朗西斯克里克发表论蛋白质合成的演讲，提出DNA制造蛋白质的概念。1958年梅索森和斯塔尔利用氮

15、标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制。1958年克里克于提出中心法则。1960年”西德尼布伦、弗朗西斯克里克等人发现信使RNA(mRNA)。1966年美国科学家马歇尔尼伦伯格（MarshallWarrenNirenberg）与罗伯特霍利（RobertW.Holley）及哈尔葛宾科拉纳（HarGobindKhorana）阐明遗传密码，每三个核苷酸组成的三联体。1967年，研究证实基因实际上就是DNA大分子中的一个片段，是控制生物性状的遗传物质的功能单位和结构单位。1972年 美国生物化学家保罗伯格创造出第一个重组DNA分子。重组技术的出现被认为是分子生物学的第二次革命。Paul Be

16、rg(1926-）相应的三大关键技术：DNA切割，分子克隆，快速测序1977年美国科学家沃尔特吉尔伯特、弗雷德里克桑格和艾伦M马克希姆开发出DNA测序技术。1980s，T.Cech 和S.Altman发现了核酶(ribozyme)。核酶是具有催化功能的RNA分子。1986年，Gibert提出”RNA世界”假说1982年 基因银行(GeneBank）数据库建立。1984年 英国遗传学家埃里克杰弗里发明了基因指纹技术，可以用人的头发、血液和精液等来鉴定身份。1986年 美国科学家莱诺伊胡德开发DNA自动测序机。1988年 人类基因组组织（HUGO）成立。基因组基因组(Genome)：包含包含细胞或

17、生物体的细胞或生物体的全套遗传全套遗传信息信息的全的全 部遗传物质部遗传物质 原核生物原核生物(细菌、病毒等细菌、病毒等)真核生物真核生物(真菌、植物、动物等真菌、植物、动物等)人类基因组：人类基因组：3.2109 bp，含有约，含有约4万个万个 基因基因HGP的最初目标的最初目标通过国际合作，用15年时间(19902005)至少投入30亿美元，构建详细的人类基因组遗传图和物理图，确定人类DNA的全部核苷酸序列，定位约10万基因，并对其它生物进行类似研究。4张图：遗传图 物理图 序列图 基因图HGP的终极目标的终极目标阐明人类基因组全部DNA序列；识别基因；建立储存这些信息的数据库；开发数据分

18、析工具；研究HGP实施所带来的伦理、法律和社会问题。出生日期：1996年7月5日死亡日期：2003年2月14日1996年 苏格兰罗斯林研究所培育出世界上第一例体细胞克隆动物小羊“多利”,并于1997年首次向公众报道。2000 Celera公司宣布完成果蝇基因组测序 国际公共领域宣布完成第一个植物基因组拟南芥全基 因组的测序工作2000.6.26 公共领域和Celera公司同时宣布完成人类基因组工作草图2001.2.15 Nature刊文发表国际公共领域结果2001.2.16 Science刊文发表Celera公司及其合作者结果Drosophila melanogaster果蝇果蝇Arabido

19、psis thaliana拟南芥拟南芥2001年年2月月15日日Nature封面封面2001年年2月月16日日Science封面封面2001年年8月月26日日 人类基因组人类基因组“中国卷中国卷”的绘制工作宣告完成。的绘制工作宣告完成。2002年年 水稻、小鼠、疟原虫等基因组测序完成水稻、小鼠、疟原虫等基因组测序完成2003年年4月月14日日 中、美、日、德、法、英等中、美、日、德、法、英等6国科学家宣布人类基因国科学家宣布人类基因组序列图绘制成功。组序列图绘制成功。2004年年10月人类基因组完成图公布。月人类基因组完成图公布。1998年 美国华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨

20、诸塞大学癌症中心的Craig Mello发现干扰现象。从此小RNA成为科研热点。2006年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁菲尔(Andrew Z.Fire)和克雷格梅洛(Craig C.Mello)，以表彰他们发现了RNA干扰现象。2004年 美科学家发现导致细胞癌变的基因。MYC基因控制MYC蛋白质的生成。这种蛋白质控制细胞分裂，如果它在实验鼠体内表达过度，细胞分裂便会加速，最终形成肿瘤。研究中，通过转基因技术使实验鼠细胞中的MYC基因不断“开启”，所以其体内的MYC蛋白质出现过剩。一段时间后，实验鼠的一些肝脏细胞便出现了癌变。科学家向实验鼠体内注入普通的抗生素强力霉素，使MYC

21、基因“关闭”。一段时间后，实验鼠肝脏上的癌细胞又逐渐转化为正常细胞。他们随后停止向实验鼠注射抗生素，其肝脏细胞又开始发生癌变，从而证明了MYC基因对癌细胞产生的特殊作用。2007年11月20日，日本京都大学的山中伸弥（Shinya Yamanaka)和美国威斯康星大学的詹姆斯汤姆森（James Thomson）分别在细胞和科学杂志上发表重量级论文，宣布他们用基因改造的手段，将人类体细胞改造成了类胚胎干细胞，在功能上几乎可以和胚胎干细胞相媲美。诱导多功能性干细胞（诱导多功能性干细胞（induced pluripotent stem induced pluripotent stem cells,i

22、PScells,iPS）被科学杂志评出2007年十大科技突破之一日本科学家山中伸弥组的文章发表在细胞杂志上詹姆斯汤姆森小组的论文发表在科学杂志上Yamanaka小组利用的是4种基因Oct3/4，Sox2，c-Myc和 Klf4，基因载体为逆转录病毒载体。用于基因重组的细胞分别来自一位36岁妇女的表皮和一位69岁男性的结缔组织。研究人员表示，利用该技术，大约每5000个细胞就能制造一个iPC细胞系，这一高效率保证他们在每项实验中都能得到数个细胞系。而Thomson小组最终也使用了4个基因OCT3，SOX2，NANOG和LIN28，其中前两个和Yamanaka小组是相同的。基因载体为慢病毒载体，T

23、homson和同事利用的是胎儿皮肤细胞以及一个新生儿的包皮细胞。与Yamanaka小组相比，这项研究需要1万个细胞才能分离出一个iPC细胞系，但对实验而言已经足够了。2009年，自然发表了中国科学院动物研究所研究员周琪领导的研究组和上海交通大学医学院教授曾凡一领导的研究组共同完成的一项研究成果，我国科学家首次利用老鼠皮肤成纤维细胞获得iPS细胞（诱导性多能干细胞），然后将ips细胞通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，从而在世界上第一次证明了iPS细胞的全能性。即从皮肤克隆出老鼠。该研究入选2009年时代周刊十大医学突破研究人员制备了37株iPS细胞，利用其中6株iPS细胞系注射了1

24、500多个四倍体胚胎，最终3株iPS细胞系获得了共计27个活体小鼠（当然还需用老鼠子宫），经多种分子生物学技术鉴定，证实该小鼠确实从iPS细胞发育而成，有些小鼠现已发育成熟并且繁殖了后代。这项工作为进一步研究iPS技术在干细胞、发育生物学和再生医学领域的应用提供了技术平台。目前iPS技术仍然有待解决的问题，其一是发展诱导iPS细胞的限定化学成分培养基，其二是对iPS细胞进行更详细的特征分析，确认其与人类胚胎干细胞是否存在极大临床差异。同卵双生的双胞胎虽然具有相同卵双生的双胞胎虽然具有相同的同的DNADNA序列，却存在表型的序列，却存在表型的差异和疾病易感性的差异差异和疾病易感性的差异v癌症的治

25、疗v有机物如何成为生物v思维如何形成v人类的起源DNA DNA 甲基化甲基化甲基化（DNAmethylation）DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。5-Methylcytosine(5mC)？DNA甲基转移酶从提出来伊始，花了很多人十几年的功夫，却一直悬而未决！从提出来伊始，花了很多人十几年的功夫，却一直悬而未决！因为因为DNADNA去甲基化这个过程只限于卵子受精后分裂前和生殖细去甲基化这个过程只限于卵子受精后分裂前和生殖细胞生成过程，时间窗口很短，细胞来源有限，无法获

26、得足够数胞生成过程，时间窗口很短，细胞来源有限，无法获得足够数量的细胞或组织进行分子生物学操作来鉴定基因，更无法进行量的细胞或组织进行分子生物学操作来鉴定基因，更无法进行生化操作去纯化酶，因此研究起来极其困难。生化操作去纯化酶，因此研究起来极其困难。2005年，哈佛大学教授施扬的实验室发现第一个组蛋白去甲基化酶LSD1和催化机制，2006年，北卡大学张毅发现一类含有JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶，均引起轰动，这也鼓舞了人们去寻找和鉴定DNA去甲基化酶的信心。1.Yujiang Shi,F.L.,Caitlin Matson,Peter Mulligan,Johnathan R.Whetsti

27、ne,Philip A.Cole,Robert A.Casero,and Yang Shi(2004).Histone Demethylation Mediated by the Nuclear Amine Oxidase Homolog LSD1.Cell 119:13.2.Yu-ichi Tsukada,J.F.,Hediye Erdjument-Bromage,Maria E.Warren,Christoph H.Borchers,Paul Tempst&Yi Zhang(2006).Histone demethylation by a family of JmjC domain-containing proteins.Nature 439:6.北大尚永丰实验室报道了在卵巢癌细胞有基因特异性“主动DNA去甲基化”的现象，美国朱健康实验室在植物发现并鉴定了去甲基化酶。然而，哺乳动物的DNA去甲基化酶，依然是“犹抱琵琶半遮面”，“千呼万唤不出来”。终于迎来终于迎来2009-20102009-2010，这时，这时，DNADNA去甲基化酶才去甲基化酶才“千呼万唤千呼万唤始出来始出来”，正式走上舞台中央，成为耀眼的新星。，正式走上舞台中央，成为耀眼的新星。讨论讨论 对转基因技术的看法对转基因技术的看法