二代测序(NGS)实验方案和应用.docx
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1、.这里为您介绍二代测序的相关流程和应用。随着人类基因组工程的完成,对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的进展。这些的测序平台允许进展高通量测序, 具有广泛的应用: 全基因组从头测序或者重测序 目标序列重测序 转录组分析 微生物组争论 基因调控争论NGS 序列二代测序仪器有很多种组合,在通量、片段长度、准确度、每一轮测序本钱、每百万碱基对测序本钱、初始本钱、规格和技术方面存在 存在差异。从规格和初始本钱的角度而言,二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围,也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器。台式测序仪使得任何试验室都可以像使用 real-time PCR 一样,自己进展测序。这些仪
2、器可以和一些靶标序列富集技术相结合,用在一些临床的应用中,其中:选定的靶标基因用于深度分析,以检测稀有的突变,或者检测多样样本中比方癌症样本中的突变。目前,这些仪器的通量在 10 Mb 到 7.5 Gb 之间,但是随着硬件,软件和试剂的持续改善,通量也在稳步增加。高通量测序仪格外适合于大量的,基因组范围的争论,每次测序能测定 600 Gb 的序列。一些这样的高通量和高精度的平台,能测定的片段长度相对较短,这对于高重复性的序列和未知基因组的从头测序就可能成为问题。与此相反,也有一些仪器能测序的片段较长到达2500 bp,但是其精度和测序力量 90 Mb要低很多。还有一些测序力量位于两者之间的仪器
3、 800 bp,700 Mb。因此,应用打算了哪一种仪器是最适宜的。有一种的方法被称作“纳米孔测序”。这种技术中,依据一个 DNA 链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的转变,可以确定通过这个孔道的碱基。这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体,而不需要生成的 DNA 链。DNA 测序二代 DNA 测序的工作流程如下: DNA 样本制备 文库构建和验证 文库分子大规模平行克隆扩增 测序二代测序 DNA 样本的质量掌握首先,评价基因组 DNA 的质量是格外必要的完整性和纯度。凝胶电泳法.基因组 DNA 的完整性和大小,可以用常规或者脉冲场琼脂糖凝胶电泳(PFGE)来检测。常规的凝胶电泳
4、的准确度不高,这是由于大的 DNA 分子在凝胶中移动的时候,本质上是用一种与尺寸无关的方式一起移动的。但是,它仍旧能够供给完整性大小范围和纯度 RNA 污染物在凝胶底部形成脱尾条带方面的有效信息。因此,它仍旧是评价基因组 DNA 质量的有效方法之一。注:RNA 污染会导致 DNA 浓度高估,并且抑制一些下游步骤。假设能确定有 RNA 污染,则可使用去 DNase 的 RNase I 处理样本。分光光度测定法分光光度仪在 260 nm 和 280 nm 处读数的比例A260/A280可以用来估量 DNA 相对于一些吸取紫外光的杂质比方蛋白的纯度。纯洁的 DNA 的 A260/A280 比例大约为
5、 1.71.9。注:想要获得准确的 A260/A280 值,需要在弱碱性的缓冲溶液中测定吸光度(比方, 10 mM TrisCl, pH 7.5)。其次个步骤是测定基因组 DNA 的浓度。分光光度法DNA 的浓度可以通过使用分光光度仪测定其在 260 nm 波长的吸光度来确定。Nanodrop 目前被广泛使用,由于它需要的样本量少(1 l), 并且使用便利不需要比色皿。为了确保结果的牢靠性,读数应当在 0.1 到 1.0 之间。注:吸光度测定不能区分 DNA 和 RNA。RNA 污染物会导致 DNA 浓度高估。但是,纯洁 RNA 的 A260/A280 比值在 2.0 左右,而纯洁的DNA 大
6、约为 1.8。因此,假设这个值为 1.95,那么说明样本里面有 RNA 杂质。注:苯酚在 270275 nm 的波长范围内有最大的吸光度,格外接近于 DNA。因此苯酚能提高样本在 260 nm 四周的吸光度,从而导致高估 DNA 的产量和纯度。荧光法荧光法使用荧光染料测定 DNA 的浓度,具有特异性和灵敏性。Hoechst 33258 结合到 DNA 上后,能增大 458 nm 波长四周的发光强度, 除此之外,也可以使用一些更加灵敏的荧光染料,比方 PicoGreen 染料。基于 PicoGreen 染料的试验,比紫外吸光光度法灵敏 10,000 倍,而比使用 Hoechst 33258 染料
7、的方法至少灵敏 400 倍。和紫外吸光光度法不同,PicoGreen 试验对双链 DNA 的选择性要远高于 RNA 和单链 DNA。DNA 标准品和样本与荧光染料混合,并且使用荧光计检测。将样本的测定结果与标准品的测定结果相比较,以确定 DNA 的浓度。Real-time PCR可以使用 real-time PCR 技术来测定 DNA 样本的数量和质量。多重PCR 技术使用引物集在多个位点扩增不同大小的片段,是检测 DNA 损伤和片段化的有效质控手段。此类技术试验特地测定可经 PCR 扩增,适于二代测序的 DNA 分子。上述提到的这些常规方法,通常不能测定的样本中扩增得到的 DNA 的量,或者
8、会高估了 DNA 的量。与它们相比,real-time PCR 更加适用于推测 DNA 样本是否适合于二代测序。文库制备对于大多数商业化的二代测序平台,使用诸如桥式扩增或者乳液 PCR 方法,对文库中的 DNA 片段进展克隆扩增,以产生足够拷贝数量的测序模板格外必要。通过将平台特异性的适配子与感兴趣的 DNA 源比方基因组 DNA、双链 cDNA 或者 PCR 扩增子等所产生的 DNA 片段退火,得到片段文库。适配子序列的存在,使得我们可以对文库分子进展选择性的克隆扩增。因此,这种方法不需要像传统的方法那样,在微生物中间体中,对基因组片段进展微生物克隆。另外,适配子序列中,还含有平台特异性的测
9、序引物的结合位点。通常状况下,一个常规的 DNA 文库构建方案包含四步: 片段化 DNA 对 DNA 片段进展末端修复 连接适配子序列不适用于单分子测序 对可选的文库进展扩增目前有四种方法用于产生基因组 DNA 碎片:酶消化法、超声波法、喷雾法和水动力剪切法。这四种方法都可以用于文库构建,但是每一种方法都有其优点和局限性。核酸内切酶消化的方法快速并且简洁,但是难以准确的掌握片段长度的分布。另外这种方法可能会对基因组 DNA 的呈递引入偏倚。另外三种技术使用物理的方法将 DNA 的双链打断,这种断裂是随机的,因此能在文库中对 DNA 进展无偏的呈递。可以使用琼脂糖凝胶电泳或者自动化的 DNA 分
10、析方法,对 DNA 片段的尺寸分布进展掌握。片段化 DNA 之后,需要将DNA 修复,产生 5磷酸化的平末端 DNA,以便能够和测序平台特异性的适配子相连接。文库构建的效率直接依靠于 DNA 末端修复的效率和准确性。末端修复混合溶液将 5或者 3的粘性末端转变成 5磷酸化的平末端 DNA。在大多数状况下,末端修复通过 T4 DNA 聚合酶的 53聚合酶活性和 35的核酸外切酶活性完成。而 T4 多聚核苷酸激酶确保平末端的 DNA 片段 5端的磷酸化,以便进展后续的适配子连接。依据所使用的测序平台,平末端DNA 片段可以直接与适配子连接,或者需要在其片段的 3端增加一个单独的突出的腺苷酸 A,以
11、便与平台特异性适配子上突出的胸苷酸 T 相互配对。通常状况下,使用 Klenow 片段具有最低的 3到 5端的核酸外切酶活性,或者使用其它具有末端转移酶活性的聚合酶催化这一步骤。T4 DNA 连接酶将双链的适配子与文库片段修复过的末端相连,然后使用回收反响或者依据 DNA 的尺寸,选择性去除文库中未连接的适配子和适配子二聚体。大小筛选方法包括使用琼脂糖凝胶电泳分别,使用磁珠或者使用高等的基于柱的纯化方法。在连接过程中可能消灭适配子的二聚体,它们会和与适配子连接的文库片段共同扩增,从而降低测序平台对真正文库片段测序的力量并且降低测序的质量, 因此在测序之前,必需将它们从文库中除去。一些测序平台要
12、求文库片段的长度分布在比较窄的范围内,以得到最正确的结果,很多时候, 这只能通过去除凝胶电泳上的相应的片段条带实现。这种方法也可以用来去除适配子二聚体。完成这一步骤之后,应当对DNA 片段文库的质量进展检测,并进展定量检测。依据浓度和测序文库的适配子设计,既可以直接稀释溶液并用于测序,也可以对文库进展选择性扩增。在文库扩增阶段,使用高保真的 DNA 聚合酶,合成完整的适配子序列,通过与 PCR 引物的重叠,用于后续的克隆扩增和与测序引物结合,或者提高 DNA 文库的产量。为了得到最正确的文库扩增结果,要求 DNA 聚合酶具有高保真性和最小的序列偏倚。文库质量评估方法,参见 NGS 文库质控。为
13、了充分利用测序力量,不同样本得到的测序文库可以放在一起,在同一轮试验中一同测序。通过将DNA 片段与具有不同特征的适配子相连接,可以实现这一过程,即对于每一个样本使用不同的短核苷酸序列作为适配子。有一些其它的方法可以用于简化文库构建。有一种方法使用转位酶/DNA 的复合物进展体外转座,以便在同一个试管中同时将 DNA 片段化并标记。通过对所标记的 DNA 片段进展有限次数的 PCR 扩增,可以构建完整的测序文库,这节约了操作步骤和时间。但是,使用体外转座构建的文库,与传统方法构建的文库相比,具有更高的序列偏倚。NGS 文库质控高质量的文库是成功进展其次代测序的关键。文库构建包含简单的步骤,比方
14、片段化样本、修复末端、将末端腺苷酰化、连接适配子和 扩增文库。依据使用的平台和文库类型,这些步骤也会发生变化。监控每一个步骤格外必要,包括在片段化样本之后检查片段的尺寸, 以及连接适配子之后检查片段的大小和浓度。文库验证过程中,需要分析文库中片段的大小和数量,这是质控的最终步骤。评估文库中片段的大小琼脂糖和 凝胶电泳是传统的检测片段大小的方法,它们比较耗时。最近,基于微流技术的电泳或者毛细管电泳越来越广泛的用于检测片段的大小和浓度。即买即用的芯片和胶盒省去了配置凝胶的步骤, 使用便利。它们具有更高的通量,并且省去了很多的手动操作时间。除此之外,它们的灵敏度更高对于检测的限制更少,并且能完 全自
15、动化的猎取数据和输出电子化的数据资料。这些仪器能同时检测片段的大小和浓度。 测定文库中的片段数量 分光光度法和荧光法 参见分光光度法和荧光法电泳设备如前所述,基于微流技术的电泳和毛细管电泳除了供给片段大小的信息之外,还供给了定量检测数据。但是,电泳、分光光度法和荧光 法的一个共同的局限性是,都只检测总的核苷酸的浓度,而非与适配子连接的分子的浓度。Real-time PCR将适配子连接到文库分子的两端,使得可以在平行的 PCR 扩增步骤中扩增上百万个独立的 DNA 分子乳液 PCR 或者桥式 PCR。在有些仪器中,乳液 PCR 可以将一个 DNA 分子扩增到数百万个一样序列的拷贝,并全都结合在同
16、一个珠子上。在另一种平台上,桥式 PCR 能够将一个 DNA 分子转变成一个包含一样序列的多个拷贝的 DNA 簇。因此,两端连接了适配子的扩增之后的分子,打算了乳液 PCR 中模板和珠子的比例以及桥式 PCR 中产生的最正确 DNA 簇。对扩增后的文库中的分子进展准确的定量检测,对于确保片段的质量和高效的获得数据是格外重要的。低估扩增文库中的分子数量,会导致混杂的信号以及难以解析的数据;相反地,高估分子的数量会降低结合模板的珠子或者 DNA 簇的产量,并且没有充分利用测序力量。Real-time PCR 能够特异性的定量检测两端结合有适配子的 DNA 分子,因此能够对扩增文库中的分子进展高度准
17、确的定量检测。Real-time PCR 的灵敏性格外高,可以对浓度格外低的文库分子进展定量检测,即使其浓度低于传统方法可以检测的阈值。因此,这种方法能尽量削减对文库的扩增,降低可能的偏倚。用于决对定量检测的数字 PCR数字 PCR 能够对二代测序的文库进展确定定量检测,而不需要标准品。这个技术对文库进展有限的稀释,并进展大量独立的 PCR 反响;因此,大多数反响没有模板,得到阴性的结果。一个单独的阳性PCR 反响统计为一个单独的模板分子。通过统计全部阳性 PCR 的数量, 能够确定文库分子确实定数目。数字 PCR 的主要优点在于: 单分子的敏感性 与 PCR 扩增的效率无关,由于成功的扩增被
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