15.体内彗星试验.docx
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1、附件15体内彗星试验In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay1范围本规范确定了体内彗星试验的基本原则、要求和方法。本规范适用于化妆品原料的遗传毒性检测。2试验目的评价化妆品用原料的遗传毒性。3定义3.1 碱性单细胞凝胶电泳:在单个细胞或细胞核水平检测DNA损伤的一种敏感技术。3.2 彗星:经过电泳后细胞核的形状,形似彗星。细胞核部分形成彗星头部,在电场力的 作用下脱离细胞核的DNA片断形成彗尾。3.3 “刺猬状”细胞:显微图像下由小或模糊不清的头以及大的弥漫性尾组成的细胞。3.4 尾部DNA含量:反应总强度(彗头与彗尾之和)中彗星的强度。可反应DNA片断的
2、数量,用百分比表示。3.5 最大耐受剂量:试验期内引起动物产生轻微毒性效应的最高剂量,在这个剂量下,动 物产生明显的临床体征,如异常行为或反应,轻微的体重下降或靶组织细胞毒性,但是并不 会引起死亡或痛苦。4试验原理DNA双螺旋结构在强碱性溶液中(pH13)会松弛,在电场力的作用下,正常的DNA 保留在原位不动,而单链或双链DNA断裂所形成的DNA片断在会向阳极移动,形成彗星 状。DNA片断所形成的彗星状拖尾的长度及强度可以反应DNA片断的大小和数量。通过 检测尾部DNA含量()等终点指标可以评价DNA损伤程度。5试验基本原则动物染毒一定时间后处死并解剖动物,获取靶器官,制备单细胞悬液。单细胞悬
3、液与琼 脂糖混合后经过裂解过程去除细胞膜,并暴露于强碱性溶液(pH13)中进行DNA解旋, 经过电泳、固定、染色,在荧光显微镜下观察,通过分析软件对彗星状细胞进行分析,判定 DNA损伤程度。每个样品需分析足够数量的细胞进行最终结果评价。6溶液的配制(所有溶液均现用现配)低熔点胶以0.5%(w/v)的浓度溶于D-PBS (无Ca2+、Mg?+和酚红)溶液中,并利用微波 炉加热。配好的胶保存在37 45 ,用后弃去。6.2 1.0%-1.5% (w/v)基底层标准琼脂糖凝胶常规熔点琼脂糖经微波炉加热溶于磷酸盐缓冲液中(pH7.07.4,不含Ca2 Mg?+和酚 红),制成1.0%1.5% (w/v
4、)标准琼脂糖凝胶。6.3 裂解液用纯水配制溶液,裂解液终浓度为 100 mmol/L EDTA-2Na10 mmol/L tris-base2.5 mol/L NaCL用5 mol/L NaOH或6 mol/L HC1将溶液pH调至10,保存于4 8 冰箱中。试 验前,向裂解液中加入1% (v/v) triton-X100和10% (v/v) DMSO,保存于4 -8 冰箱至 少 30 mine6.4 碱性解旋液和电泳液用纯水配制溶液,碱性解旋液和电泳液终浓度为1 mmol/L EDTA-2Na和300 mmol/L NaOH, pH13,用前保存于48 c冰箱中,并测定其pH值。6.5 中和
5、液用纯水配制溶液,中和液终浓度为0.4 mol/L tris-base (用5 mol/L NaOH或6 mol/L HC1 调节pH7.5),保存于4 8 冰箱中。6.6 组织匀浆缓冲液将 EDTA-2Na 溶于 HBSS (无 Ca?+、Mg2+和酚红)中,终浓度为 20 m mol/L EDTA-2Na, 用5 mol/L NaOH或6 mol/L HC1将其pH调至7.5,保存于4 8 冰箱中,使用前加入 10% DMSOo6.7 染液DNA荧光染料(如SYBRGold、SYBR Green L Gelred、碘化丙咤或溟化乙锭等),制 备和使用按照产品要求。7实验动物和饲养环境7.1
6、 动物的选择动物的选择应符合GB 14922.1和GB 14922.2的有关规定,选用SPF级健康成年啮齿类 动物。常用6周龄以上雄性大鼠。实验开始时,动物体重的差异应不超过20%。7.2 动物饲养动物饲养条件应符合GB 14925、饮用水应符合GB 5749、饲料应符合GB 14924的有关 规定。可分笼群饲(每笼通常不超过5只),也可单笼饲养。室内的温度应控制在22(3)。 相对湿度应控制在50%60%,不低于30%,最高不超过70% (清洁时例外)。照明应控制 为12 h光照、12 h黑暗。常规饮食,自由饮水。7.3 动物分组首先应确定实验分组,动物随机分配为对照组和试验组。试验开始前,
7、实验动物至少适 应5天。一般实验设计需要三个剂量组以及阴性和阳性对照组,每组动物至少5只。编号应 使用创伤较小的方法,包括:耳孔法、标签法、烙印法、染色法。8试验条件8.1 溶剂溶剂不应该产生毒性作用,并且不应当与受试物产生化学反应。如果使用不常用的溶剂, 应有数据支持该溶剂在受试动物的应用、暴露途径及检测终点等方面是可行的。应根据受试 物的理化性质(水溶性或脂溶性)确定受试物所用的溶剂,通常用水、植物油等。应当注意 的是,某些溶剂(特别是粘稠的溶剂)多次使用后,能诱导炎症反应及在接触部位可能增加 DNA链断裂的背景水平。8.2 样品的制备固体受试物应溶于适当的溶剂中或混合在饮食或饮水中。液体
8、受试物可直接或稀释后染 毒。用吸入暴露时,根据受试物的物理化学性质,将其处理为气体、蒸汽或气溶胶。受试物 应现用现配。8.3 对照阳性对照。每次试验都应设置阳性对照,每种性别至少有3只可供分析的动物。如需进 行多次采样(例如,用单一的染毒方案),不仅需要在每一个采样点设置阳性对照,而且要 确保平行性。阳性对照的暴露途径可以与受试物不同。阳性对照物质应该能够引起靶器官产 生DNA链断裂,可以选择甲磺酸乙酯(EMS)作为阳性对照,其已经被证实能够诱发多种 组织器官产生DNA链断裂效应。阳性对照应选择能够产生中等毒性效应的剂量,同时能够 评估试验的可行性和灵敏度,可以根据实验室建立的阳性物剂量-反应
9、曲线进行选择。阳性 对照组的尾DNA含量()应该与实验室前期建立的数据范围保持一致。阳性对照物质及 其靶器官(作用于啮齿动物)见表1。也可以选择其他一些被证实阳性的物质。表1阳性对照物及其靶器官化学物及CAS.号靶器官甲磺酸乙酯EMS (CAS 62-50-0)所有组织乙基亚硝基胭(CAS 759-73-9)肝、胃、十二指肠、空肠甲磺酸甲酯MMS (CAS 66-27-3) 肝、胃、十二指肠、空肠、肺及支气管肺泡细 胞、肾、膀胱、睾丸、骨髓造血系统N甲基-N-硝基-N-亚硝基胭(CAS胃、十二指肠、空肠70-25-7)二甲基胱哦咤(CAS 306-37-6)肝、肠甲基亚硝基配(CAS 684-
10、93-5)肝、骨髓、血细胞、肾、胃、空肠、脑阴性对照。阴性对照组的动物用溶剂单独染毒,其余操作过程与试验组相同,每次试验 每个采样点每种组织都应该设置阴性对照。阴性对照组的尾DNA含量()应该在实验室 前期建立的背景数据范围之内。必要时增加空白对照。9剂量设计受试物应设3个剂量组。首先通过预试验确定最大耐受剂量,一般取最大耐受剂量及至 少两个适当间隔的剂量水平(优选剂量间隔为疝)。对于无毒物质,14天或以上的染毒期, 最大染毒剂量采用1000 mg/kg/BW/do如果染毒期少于14天,最大染毒剂量采用2000 mg/kg/BW/do10染毒方式染毒方式一般选用灌胃方式,除一些阳性物质外,一般
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- 15. 体内 彗星 试验
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