苦丁茶皂苷降血脂作用的成分研究-李小华.pdf
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1、分类号 学号 M201475299 学校代码 1 0 4 8 7 密级 硕士学位论文 苦丁茶皂苷降血脂作用的成分研究 学位申请人 : 李小华 学科专业 : 药物分析学 指导教师 : 姜宏梁教授 答辩日期 : 2016 年 5 月 _A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master A study on composition and hypolipidemic effect of total saponins from Kuding tea Candidate
2、 : Xiaohua Li Major : Pharmaceutical analysis Supervisor : Prof. Hongliang Jiang Huazhong University of Science and Technology Wuhan, Hubei 430074, P. R. China May, 2016 _ 独创性声明 本人郑重声明, 本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果的总结。尽我所知,除文中已经标明引用的内容外,本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究做出贡献的个人和集 体,均已在文中以明确方式标明
3、。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切 法律后果。 学位论文作者签名: 日期: 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版, 允许论文被查阅 和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ,在_年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密。 (请在以上方框内打“” ) 学位论文作者签名: 指导教师签名: 日期: 年 月 日 日期: 年 月 日 _ 目 录 缩略词 . 1 摘
4、要 . 2 Abstract . 4 引 言 . 6 第一章 苦丁茶中皂苷类化合物的提取分离及结构鉴定 . 7 1 前言. 7 2 实验仪器及材料. 7 2.1实验仪器 . 7 2.2实验试剂 . 7 2.3实验材料 . 8 3 实验方法. 8 3.1苦丁茶皂苷提取物的制备 . 8 3.2苦丁茶皂苷的分离 . 8 4 实验结果与讨论. 9 5 本章小结. 12 第二章 基于 UPLC-MS/MS 的苦丁茶皂苷成分的全面表征 . 13 1 前言. 13 2 实验仪器与材料. 13 2.1实验仪器 . 13 2.2实验材料 . 13 3 实验方法. 13 3.1 样品制备 . 14 3.2 色谱条
5、件 . 14 3.3质谱条件 . 14 4 实验结果与讨论. 14 5 本章小结. 16 第三章 苦丁茶皂苷的降血脂作用及机理研究 . 22 1 前言. 22 2 实验仪器与材料. 22 _ 2.1实验仪器 . 22 2.2实验试剂 . 23 2.3实验动物 . 23 3 实验方法. 23 3.1苦丁茶提取物的制备 . 23 3.2动物造模及给药 . 23 3.3小鼠血清生化指标的检测 . 23 3.4组织形态学观察 . 25 3.5总 RNA 制备 . 25 3.6小鼠肝脏总 RNA的纯度的检测 . 26 3.7 小鼠肝脏 CDNA 的合成. 26 3.8 引物的设计与合成 . 26 3.9
6、实时定量 RT-PCR 基因表达 . 27 4 结果与讨论. 28 4.1苦丁茶皂苷对高脂血症小鼠生化指标的干预作用 . 28 4.2苦丁茶皂苷提取物干预后高脂血症小鼠肝脏组织的形态学分析 . 29 4.3 苦丁茶皂苷提取物对高脂血症小鼠降血脂相关基因表达的干预作用30 4.3.1 苦丁茶皂苷干预高脂血症小鼠肝脏 HMG-COA基因表达的影响 . 30 4.3.2苦丁茶皂苷干预高脂血症小鼠肝脏 LDL-R基因表达的影响 . 30 4.3.3苦丁茶皂苷干预高脂血症小鼠肝脏清道夫受体基因表达的影响 . 30 5 本章小结. 31 总 结.33 综 述 . 34 参考文献 . 38 致 谢 . 48
7、 附录:苦丁茶中分离得到的化合物核磁图谱 . 49 _ _ 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 缩略词 缩略词 英文全称 中文全称 UPLC Ultra-high performance liquid chromatography coupled with MS/MS Tandem mass Spectrometry 超高效液质联用 QTOF Triple quadrupole linear ion trap 飞行时间质谱 TC Total cholesterol 总胆固醇 TG Triglyceride 甘油三酯 HDL High denistyi liportien 高密度
8、脂蛋白 LDL Low denistyi liportien 高密度脂蛋白 HDL-C High-density lipoprotein cholesterol 高密度脂蛋白-胆固醇 LDL-C low-density lipoprotein cholesterol 低密度脂蛋白-胆固醇 AI Aeorsclerosis index 动脉粥样硬化指数 AS Ahteorcsleoriss 动脉粥样硬化 HFD Highaftdiet 高脂膳食 CD36 Cluster of differentration 36 36 分化抗原簇 SA Scavenger receptor 清道夫受体 SA-B
9、I Scavenger receptor class B type I B类清道夫受体 I SA-AI Scavenger receptor class A type I A类清道夫受体 I OxLDL oxidizedlowdensitylipoprotein 氧化型低密度脂蛋白 PBS Phosphate buffer saline 磷酸盐缓冲液 LCAT Lecihtincholesteorlacyltransferase 卵磷脂胆固醇酞基转移酶 Hmgcr 3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase 3-羟基 3-甲基戊 二酸单酰辅酶
10、 A 还原酶 XIC Extracted ion chromatogram 提取离子流色谱图 RCT Reverse cholesterol transport 胆固醇逆转运 _ 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 苦丁茶皂苷降血脂作用的成分研究 研究生:李小华 导 师:姜宏梁教授 摘 要 苦丁茶(Ilex kudincha C.J.Tseng)是冬青科冬青属乔木植物的嫩叶,为药食 同源的常用中药。为阐明苦丁茶皂苷降血脂的药效物质基础,本论文以高脂血症 小鼠模型对其降血脂活性进行了确证,同时利用实时定量 PCR 技术初步阐明了 苦丁茶皂苷降血脂的作用机理, 并运用超高效液相飞行
11、时间串联质谱技术对苦丁 皂苷部位的化学成分进行了全面的表征, 为苦丁茶的开发和利用提供了新的科学 依据。 方法:采用硅胶柱色谱层析、反相 C 18 半制备等传统的植物化学分离模式, 对苦丁茶皂苷成分进行分离并进行结构鉴定。结合 QTOF-MS/MS 对苦丁茶皂苷 提取物中的所有皂苷成分进行结构表征。通过高脂饲料建立高脂血症小鼠模型, 随机 4 组,即苦丁茶皂苷 TS L 组(50 mg/kg )、 苦丁茶皂苷 TS H 组(100 mg/kg )、 P group(simvastain tablets 20 mg/kg )、 H group 组,另取同步饲养的正常小鼠作 为 C group 组
12、,每组 8只,连续灌胃给药 4周后,眼眶后静脉丛取血,分离血清, 检测所有小鼠血清中一系列生化血脂指标变化;油红 O 染色观察肝脏组织病理 形态学。然后从基因表达方面采用实时定量 PCR 的方法研究实验小鼠肝脏中与 脂代谢相关的五种基因的表达情况,初步阐述苦丁茶皂苷降血脂的作用机理。 结论:共分离出 6个化合物分别是: kudinoside A 、 kudinoside D、 kudinoside F、ilekudinoside R、ilekudinoside D、ilekudinoside M,并表征出 52个皂苷累化 合物,为苦丁茶皂苷降脂药效物质基础和质量控制奠定了基础。药效结果发现与
13、模型组比较,苦丁茶皂苷治疗组小鼠血清中 TC、LDL-C、AI 均显著减低,证明 苦丁茶皂苷提取物对高脂血症有显著的预防作用; 肝脏组织染色结果显示苦丁茶 皂苷提取物能改善高脂饲料引起的肝脏脂肪变性;实时定量 PCR实验结果表明 与高脂模型组比较,苦丁茶皂苷提取物能够显著上调高脂血症小鼠肝脏中的 Hmgcr、LDL-R、SR-BI、SR-A和 CD36水平,从基因表达方面初步阐明了苦丁 _ 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 茶皂苷的降血脂药效作用靶标和作用机理。 关键词 苦丁茶皂苷;高脂血症;超高效液相飞行时间串联质谱;清道夫 受体 _ 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位
14、 论 文 4 A study on composition and hypolipidemic effect of total saponins from Kuding tea Abstract Ilex kudincha C. J. Tseng is belonged to the Aquifoliaceae family, the leaves of Ilex kudingcha are used as an ethnomedicine in the treatment of symptoms related with diabetes mellitus and obesity throu
15、ghout the centuries in China. Nowadays it becomes the research topic in the study of functional food medicine for the treatment of cardiovascular-related diseases, diabetes mellitus and obesity. In the present study, the bioactive components of Kuding tea was systematically studied using UPLC-QTOF-M
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