化妆品微生物检验方法.doc
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1、|一、 总 则1.范围本规范规定了化妆品微生物检验的基本要求。本规范适用于化妆品样品的采集、保存及供检样品制备。2.仪器和设备2.1 天平。2.2 高压灭菌器。2.3 振荡器。2.4 三角瓶,250mL。2.5 玻璃珠。2.6 琉璃棒。2.7 刻度吸管,1mL、10mL。2.8 研钵或均质器。2.9 恒温水浴箱。3.培养基和试剂3.1 生理盐水成分:氯化钠 8.5g蒸馏水加至 1000mL溶解后,分装到加玻璃珠的三角瓶内,每瓶 90 mL,103.43kPa (121 15 lb)20min 高压灭菌。3.2 SCDLP 液体培养基成分:酪蛋白胨 17g大豆蛋白胨 3g氯化钠 5g磷酸氢二钾
2、2.5g葡萄糖 1g吐温 80 7g蒸馏水 1000mL制法:先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后,再与其它成分混合,加热溶解,调 pH 为 7.27.3 分装,103.43 kPa (121 15 lb)20min 高压灭菌。注意振荡,使沉淀于底层的吐温 80 充分混合,冷却至 25左右使用。注:如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨,也可用多胨代替。3.3 灭菌液体石蜡。3.4 灭菌吐温 80。4.样品的采集及注意事项4.1 所采集的样品,应具有代表性,一般视每批化妆品数量大小,随机抽取相应数量的包装单位。检验时,应分别从两个包装单位以上的样品中共取 10g 或 10mL。包装量小于 20g 的样品,采样
3、量可适当增加样品包装数量。4.2 供检验样品,应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂,在检验前不得打开,防止样品被污染。4.3 接到样品后,应立即登记,编写检验序号,并按检验要求尽快检验。如不能及时检验,样品应放在室温阴凉干燥处,不要冷藏或冷冻。4.4 若只有一个样品而同时需做多种分析,如细菌、毒理、化学等,则宜先取出部分样品做细菌检验,再将剩|余样品做其它分析。4.5 在检验过程中,从打开包装到全部检验操作结束,均须防止微生物的再污染和扩散,所用器皿及材料均应事先灭菌,全部操作应在无菌室内进行,或在相应条件下,按无菌操作规定进行。4.6 如检出粪大肠菌群或其它致病菌,自报告发出之日起该菌种
4、及被检样品应保存一个月。5.供检样品的制备5.1 液体样品5.1.1 水溶性的液体样品,可量取 10mL 加到 90mL 灭菌生理盐水中,如样品少于 10mL,仍按 10 倍稀释法进行。如为 5mL 则加到 45mL 灭菌生理盐水中,混匀后制成 1:10 检液。5.1.2 油性液体样品,取样品 10mL,先加 5mL 灭菌液体石蜡混匀,再加 10mL 灭菌的吐温 80,在 4044水浴中充分混合,制成 1:10 检液。5.3 固体样品称取 10g,加到 90mL 灭菌生理盐水中,充分振荡混匀,使其分散混悬,静置后,取上清液作为 1:10 的检液。如有均质器,上述水溶性膏、霜、粉剂等,可称 10
5、g 样品加入 90mL 灭菌生理盐水,均质 1min2min;疏水性膏、霜及眉笔、口红等,称 10g 样品,加入 10mL 灭菌液体石蜡,10mL 吐温 80,70mL 灭菌生理盐水,均质 3min5min。二、菌落总数1.范围本规范规定了化妆品中菌落总数的检验方法。本规范适用于化妆品菌落总数的测定。2.定义本规范采用下列定义菌落总数(Aerobic bacterial count)是指化妆品检样经过处理,在一定条件下培养后(如培养基成分、培养温度、培养时间、pH 值、需氧性质等) ,1g(1mL)检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。测定菌落
6、总数便于判明样品被细菌污染的程度,是对样品进行卫生总评价的综合依据。3.仪器和设备3.1 三角瓶,250mL。3.2 量筒,200mL。3.3 pH 计或精密 pH 试纸。3.4 高压灭菌器。3.5 试管:15150mm。3.6 灭菌平皿:直径 9cm。3.7 灭菌刻度吸管,10mL、1mL。3.8 酒精灯。3.9 恒温培养箱:361。3.10 放大镜。4.培养基和试剂4.1 生理盐水:见总则中 3.1。|4.2 卵磷脂、吐温 80-营养琼脂培养基4.2.1 成分:蛋白胨 20g牛肉膏 3g氯化钠 5g琼脂 15g卵磷脂 1g吐温 80 7g蒸馏水 1000mL4.2.2 制法:先将卵磷脂加到
7、少量蒸馏水中,加热溶解,加入吐温 80,将其他成分(除琼脂外)加到其余的蒸馏水中,溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐温 80,混匀,调 pH 值为 7.17.4,加入琼脂,103.43kPa (121 15 lb)20min高压灭菌,储存于冷暗处备用。4.3 0.5%氯化三苯四氮唑( 2,3,5-triphenyl terazolium chloride,TTC)成分:TTC 0.5g蒸馏水 1000mL溶解后过滤,103.43kPa (121 15 lb)20min 高压灭菌,装于棕色试剂瓶,置 4冰箱备用。5.操作步骤5.1 用灭菌吸管吸取 1:10 稀释的检液 2mL,分别注入到两个灭菌平皿内
8、,每皿 1mL。另取 1mL 注入到 9mL 灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面) ,更换一支吸管,并充分混匀,制成 1:100 检液。吸取 2mL,分别注入到两个灭菌平皿内,每皿 1mL。如样品含菌量高,还可再稀释成 1:1000,1:10000,等,每种稀释度应更换 1 支吸管。5.2 将融化并冷至 4550的卵磷脂吐温 80 营养琼脂培养基倾注到平皿内,每皿约 15 mL,随即转动平皿,使样品与培养基充分混合均匀,待琼脂凝固后,翻转平皿,置 361培养箱内培养 48h2h。另取一个不加样品的灭菌空平皿,加入约 15mL 卵磷脂吐温 80 营养琼脂培养基,待琼脂凝固后,翻转平皿,置
9、361培养箱内培养48h2h,为空白对照。5.3 为便于区别化妆品中的颗粒与菌落,可在每 100mL 卵磷脂吐温 80 营养琼脂中加入 1mL 0.5%的 TTC 溶液,如有细菌存在,培养后菌落呈红色,而化妆品的颗粒颜色无变化。6菌落计数方法先用肉眼观察,点数菌落数,然后再用放大 5 倍10 倍的放大镜检查,以防遗漏。记下各平皿的菌落数后,求出同一个稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时,该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半,而其余一半中菌落数分布又很均匀,则可将此半个平皿菌落计数后乘以 2,以代表全皿菌落数。7.菌落计数及报告方法7.1 首先选取平
10、均菌落数在 30 个300 个之间的平皿,作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时,即以该平皿菌落数乘其稀释倍数(见表 1 中例 1) 。7.2 若有两个稀释度,其平均菌落数均在 30 个300 个之间,则应求出两菌落总数之比值来决定,若其比值小于或等于 2,应报告其平均数,若大于 2 则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数(见表 1 中例 2 及例 3) 。7.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于 300 个,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表 1中例 4) 。7.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于 30 个,刚应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之
11、(见表 1中例 5) 。7.5 若所有稀释度的平均菌落数均不在 30 个300 个之间,其中一个稀释度大于 300 个,而相邻的另一稀释度|小于 30 个时,则以 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表 1 中例 6) 。7.6 若所有的稀释度均无菌生长,报告数为每 g 或每 mL 小于 10 CFU。7.7 菌落计数的报告,菌落数在 10 以内时,按实有数值报告之,大于 100 时,采用二位有效数字,在二位有效数字后面的数值,应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数,可用 10 的指数来表示(见表 1 报告方式栏) 。在报告菌落数为“不可计”时,应注明样品的稀释度。表 1
12、 细菌计数结果及报告方式不同稀释度平均菌落数例次10-1 10-2 10-3两稀释度菌数之比菌落总数(CFU/mL 或CFU/g)报告方式(CFU/mL 或 CFU/g)1 1365 164 20 16400 16000 或 1.61042 2760 295 46 1.6 38000 38000 或 3.81043 2890 271 60 2.2 27100 27000 或 2.71044 不可计 4650 513 513000 510000 或 5.11055 27 11 5 270 270 或 2.71026 不可计 305 12 30500 31000 或 3.11047 0 0 0 1
13、10 110*CFU:菌落形成单位。三、粪大肠菌群1.范围本规范规定了化妆品中粪大肠菌群的检验方法。本规范适用于化妆品中粪大肠菌群的检验。2.定义本规范采用下列定义粪大肠菌群(Fecal coliforms)系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌,在 440.5培养 24h48h能发酵乳糖产酸并产气。该菌直接来自粪便,是重要的卫生指标菌。3.仪器3.1 恒温水浴箱或隔水式恒温箱:440.5。3.2 温度计。3.3 显微镜。3.4 载玻片。3.5 接种环。3.6 电磁炉。3.7 三角瓶,250mL。3.8 试管:15150mm。3.9 小倒管。|3.10 pH 计或 pH 试纸。3.11 高压
14、灭菌器。3.12 灭菌吸管,10mL、1mL。3.13 灭菌平皿:直径 90mm。4.培养基和试剂4.1 双倍乳糖胆盐(含中和剂)培养基成分:蛋白胨 40g猪胆盐 10g乳糖 10g0.4%溴甲酚紫水溶液 5mL卵磷脂 2g吐温 80 14g蒸馏水 1000mL制法:将卵磷脂、吐温 80 溶解到少量蒸馏水中。将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解到其余的蒸馏水中,加到一起混匀,调 pH 到 7.4,加入 0.4%溴甲酚紫水溶液,混匀,分装试管(每支试管中加一个小倒管) 。68.95kPa (115 10 lb)20min 高压灭菌。4.2 伊红美蓝(EMB)琼脂成分:蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氢二钾
15、2g琼脂 20g2%伊红水溶液 20mL0.5%美蓝水溶液 13mL蒸馏水 1000mL制法:先将琼脂加到 900mL 蒸馏水中,加热溶解,然后加入磷酸氢二钾、蛋白胨,混匀,使之溶解。再以蒸馏水补足至 1000mL。校正 pH 值为 7.27.4,分装于三角瓶内,103.43kPa (121 15 lb)15min 高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至 60左右无菌操作加入灭菌的伊红美蓝溶液,摇匀。倾注平皿备用。4.3 蛋白胨水(做靛基质试验用)成分:蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g氯化钠 5g蒸馏水 1000mL制法:将上述成分加热融化,调 pH 值为 7.07.2.分装小试管,10
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- 化妆品 微生物 检验 方法
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