水产品中氯霉素的快速检测胶体金免疫层析法.doc

1附件 5水产品中氯霉素的快速检测 胶体金免疫层析法（征求意见稿）1 范围本方法规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于水产品中氯霉素的快速测定。2 原理本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础。样品中的氯霉素经有机试剂提取，固相萃 取小柱净化，浓缩复溶后，氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和微孔 膜检测线（T 线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线颜色 深浅比较，对样品中氯霉素含量进行定性判定。3 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水。 3.1 试剂 3.1.1 正己烷。 3.1.2 丙酮。 3.1.3 乙酸乙酯。 3.1.4 乙腈 3.1.5 磷酸二氢钠，NaH2PO4·2H2O。 3.1.6 磷酸氢二钠，Na2HPO4·12H2O。 3.1.7 氯化钠 3.1.8 复溶液：称取 0.12g 磷酸二氢钠 (3.1.5)置于 100ml 容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制 成溶液 A；称取磷酸氢二钠 7.16g (3.1.6)置于 100ml 容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶 液 B。取溶液 A 2.8ml、溶液 B 7.2ml、氯化钠(3.1.7)0.85g，用水溶解并稀释至 100ml，得磷酸 盐缓冲液。 3.1.9 丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2） 、正己烷（3.1.1）按体积比 1：9 混匀。 3.1.10 丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2） 、正己烷（3.1.1）按体积比 6：4 混匀。 3.2 标准物质 氯霉素参考物质的中文名称、英文名称、CAS 登录号、分之式、相对分子质量见表 1，纯 度98.6%表 1 氯霉素参考物质中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式、相对分子质量中文名称英文名称CAS 登录号分子式相对分子量氯霉素chloramphenicol56-75-7C11H12CL2N2O5323.13注：或等同可溯源物质。23.3 标准溶液配制 3.3.1 氯霉素标准储备液（1 mg/mL）：精密称取氯霉素标准品（3.2）适量，置于 10 mL 容量 瓶中，用乙腈（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 1 mg/mL 的氯霉素标准储备液。4避光保存，有效期 6 个月。 3.3.2 氯霉素标准中间液 A（10g/mL）：精密量取氯霉素标准储备液（1 mg/mL） （3.3.1）0.1 mL，置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈（3.1.4）稀释至刻度，摇匀，制成 10 g/mL 的氯霉素标准 中间液 A。4避光保存，有效期 3 个月。 3.3.3 氯霉素标准工作液（0.01g/mL）：精密移取氯霉素标准中间液 A（10g/mL） （3.3.2） 0.01 mL 分别置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 0.01 g/mL 的氯霉 素标准工作液。临用新配。 3.4 材料 3.4.1 固相萃取小柱：Cleanert Silica，200mg/6ml。LOT：0170198 3.4.2 免疫胶体金试剂盒（在 230、干燥阴凉条件下保存，在产品有效期内使用） 。 3.4.2.1 金标微孔。 3.4.2.2 试纸条或检测卡。4 仪器和设备4.1 移液器：200 L、1 mL 和 5 mL。 4.2 涡旋混合器。 4.3 离心机：转速4000 r/min。 4.4 电子天平：感量为 0.01 g。 4.5 振荡器。 4.6 样品浓缩仪：如有需要。 4.7 环境条件:温度：1525，相对湿度：60%。5 分析步骤5.1 试样制备 取具有代表性样品约 500 g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留 样，密封，标记，于常温保存。 5.2 试样提取和净化 准确称取试样 6g（精确至 0.01g）置于 50mL 具塞离心管中，依次加入 4mL 水和 8mL 乙酸 乙酯（3.1.3） ，涡旋提取 5min，以 4000r/min 离心 5min。转移全部乙酸乙酯层于 50mL 具塞离 心管中，加入正己烷 25ml，氯化钠 1g 涡旋混匀，4000r/min 离心 1min，上清液待净化。5ml 丙酮-正己烷（1+9） （3.1.9）淋洗 LC-Si 硅胶小柱，弃去淋洗液，将待净化溶液转移到固相萃取 小柱上，弃去流出液，用 5ml 丙酮-正己烷（6+4） （3.1.10）洗脱，收集洗脱液，洗脱液于 40 氮气吹干，精密加入 600µL 复溶液（3.1.8） ，涡旋混合 1min，作为待测液。 5.3 测定步骤 5.3.1 检测卡与金标微孔测定步骤 吸取 150µL 样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸 510 次使混合均匀，室温温育 3 min；温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育 58 min，对结果进行判定。 5.3.2 试纸条与金标微孔测定步骤 吸取 150µL 样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸 510 次使混合均匀，室温温育 3 min；温育结束后，将检测试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入反应微孔中，室温温育 3 3min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，并于 5 min 内进行结果判定。 5.3.3 检测卡测定步骤 吸取 150µL 样品待测液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育 58 min，对结 果进行判定。 5.4 质控试验 每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。 5.4.1 空白试验 称取空白试样，按照 5.2 和 5.3 步骤与样品同法操作。 5.4.2 加标质控试验 准确称取空白样品 6 g 或适量（精确至 0.01g）置于 50 mL 具塞离心管中，加入 60 L 氯 霉素标准工作液（0.01g/mL） （3.3.3） ，使氯霉素浓度为 0.1 g/kg，一式 2 份，按照 5.2 和 5.3 步骤与样品同法操作。6 结果判定要求通过对比控制线和检测线的颜色深浅进行结果判定。由于长时间放置会引起检测线颜色的 变化，需在规定时间内进行结果判定。目视结果判读依据如图 1 所示。 6.1 无效 控制线（C 线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。 6.2 阳性结果 检测线（T 线）不显色或检测线（T 线）颜色比控制线（C 线）颜色浅，表明样品中氯霉 素含量高于方法检测限，判定为阳性。 6.3 阴性结果 检测线（T 线）颜色比控制线（C 线）颜色深或者检测线（T 线）颜色与控制线（C 线）颜 色相当，表明样品中氯霉素含量低于方法检测限，判定为阴性。46.4 质量控制要求 空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。7 结论如被测样品中氯霉素检测结果为阳性时，应采用确证方法进行确证检测。8 性能指标8.1 检测限：氯霉素为 0.1 g/kg。 8.2 灵敏度：灵敏度应98%。 8.3 特异性：特异性应90%。 8.4 假阴性率：假阴性率应1%。 8.5 假阳性率：假阳性率应10%。注：性能指标计算方法见附录 A9 其他本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不 做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法 规定的各项性能指标。 本方法参比标准为 GB/T 22338-2008 动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定 (包括所有 修改单)。5附录 A定性方法性能计算表表 A.1 性能指标计算方法检验结果b 样品情况a 阳性阴性总数阳性N11N12N1.=N11+N12阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11+N21N.2=N12+N22N=N1.+N2.或 N.1+N.2显著性差异(2)2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21), 自由度（df）=1灵敏度（p+）p+=N11/N1.特异性（p-）p-=N22/N2.假阴性率(pf-)pf-=N12/N1.=1-灵敏度假阳性率(pf+)pf+=N21/N2.=1-特异性相对准确度（N11+N22）/(N1.+N2.)注：N:任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11 表示第一行， 第一列，N1.表示所有的第一行，N.2 表示所有的第二列；N12 表示第一行，第二列。a 由基准方法检验得到的结果； b 由本方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。本方法负责起草单位：山西省食品药品检验所。 验证单位：陕西省食品药品检验所、广东省药品检验所、四川省食品药品检验检测院。 主要起草人：李倩、阎安婷、陈煜、杨国伟。