食品中硼酸的快速检测姜黄素比色法.doc

附件 9食品中硼酸的快速检测姜黄素比色法（征求意见稿）1 范围本方法规定了食品中硼酸的姜黄素比色快速检测方法。 本方法适用于粮食制品、淀粉及淀粉制品、糕点、豆制品、速冻食品（速冻面米食品、 肉丸、蔬菜丸）中硼酸的快速测定。2 原理本方法采用姜黄素比色法的原理，通过超声辅助用水提取样品中硼酸，用乙基己二醇- 三氯甲烷溶液对样品中的硼酸进行快速的富集、萃取，利用硫酸与姜黄素混合生成的质子 化姜黄与硼酸反应生成红色产物。溶液颜色的深浅与样品中硼酸的含量成正相关，通过色 阶卡进行目视比色，确定样品中硼酸的含量。 3 试剂与材料除另有规定外，本方法所用的试剂均为分析纯，水为 GB/T6682 规定的二级水。3.1 试剂3.1.1 硫酸。 3.1.2 无水乙醇。 3.1.3 亚铁氰化钾。 3.1.4 乙酸锌。 3.1.5 姜黄素（CAS:458-37-7），纯度 99%。 3.1.6 冰乙酸。3.1.7 2-乙基-1,3-己二醇（色谱纯）。 3.1.8 三氯甲烷（色谱纯）。 3.1.9 硫酸溶液（1+1）：取等体积的硫酸（3.1.1）与水，将硫酸缓慢加入到水中，并用 玻璃棒不断的搅拌，待冷却后装入塑料容器中。 3.1.10 亚铁氰化钾溶液：称取 10.6g 亚铁氰化钾（3.1.3），用水溶解并稀释至 100mL。 3.1.11 乙酸锌溶液：称取 22.0g 乙酸锌（3.1.4），用水溶解并稀释至 100mL。3.1.12 2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液(EHD-CHCl3 溶液)：称取 2-乙基-1,3-己二醇(3.1.7) 10.6g，用三氯甲烷(3.1.8)溶解并稀释至 100mL，此溶液保存于塑料容器中。 3.1.13 姜黄-冰乙酸溶液：称取姜黄素(3.1.5)40mg，溶于 100mL 冰乙酸(3.1.6)中，此溶液 保存于塑料容器中，该溶液需临用新制。3.2 参考物质硼酸参考物质中文名称、英文名称、CAS 号、分子式、相对分子质量见表 1。表 1 硼酸参考物质中文名称、英文名称、CAS 号、分子式、相对分子质量中午名称英文名称CAS 登录号分子式相对分子质量硼酸Boric Acid10043-35-3H3BO361.83.3 标准溶液配制3.3.1 硼酸标准储备液（1000g/mL）：准确称取在硫酸干燥器中干燥 5h 以上的硼酸标 准品适量，用水溶解并配制成 1000g/mL 的标准储备液，保存于塑料容器中。 3.3.2 硼酸标准溶液（100g/mL）：取硼酸标准储备液 10.0mL，加水定容至 100mL，保 存于塑料容器中。所配制溶液于 04冰箱中可储存 3 个月。3.4 材料硼酸快速检测试剂盒，需在阴凉、干燥、避光条件下保存。4 仪器与设备4.1 电子天平：感量为 0.01g。4.2 样品捣碎机。4.3 超声仪。4.4 离心机：转速4000r/min。4.5 氮气吹干仪或空气吹干仪：温度控制60。4.6 涡旋振荡器。4.7 移液器：200µL、1mL、10 mL。5 分析步骤5.1 试样的制备取适量样品，充分粉碎混匀。5.2 试样的提取准确称取混合均匀的试样 2g（精确至 0.1g），置于 50mL 离心管中，准确加水 7mL， 加入硫酸溶液（3.1.9）2mL，涡旋振荡提取 1min 后超声提取 15min，期间振摇 23 次， 加入 0.5mL 亚铁氰化钾溶液（3.1.10）与 0.5mL 乙酸锌溶液（3.1.11） ，混匀后于 4000r/min 离心 5min(若离心效果不佳，可适当提高离心转速)，准确吸取 1.0mL 上清液于 2.0 mL 离心 管中，向离心管中加入 EHD-CHCl3溶液（3.1.12）0.5mL，上下颠倒振摇 1520 次，静置 分层（若有乳化现象，可低速离心） ，将上层溶液去除干净，取下层液体 100L 于 2.0mL 离心管中，加入 400L 姜黄素-冰乙酸溶液（3.1.13），再加入 20L 硫酸溶液（3.1.9）， 于 6070水浴中氮气（或空气）吹至近干，加入 1mL 无水乙醇，振摇使残渣全部溶 解，为待测液。注:粉丝、粉条等干基样品加入水和硫酸溶液后需浸泡 15min，再进行后续处理。5.3 测定步骤将待测液与标准色阶卡目视比色，15min 内判读结果。需进行平行试验，两次测定结 果应一致，即显色结果无肉眼可辨识差异。注意：整个试验避免在阳光直射的地方操作。5.4 质控试验每批样品应同时进行空白试验和质控样品试验（或加标质控试验）。用色阶卡和质控 试验同时对检测结果进行控制。 5.4.1 空白试验 称取空白样品，按照5.15.3步骤与样品同法操作。 5.4.2 质控样品试验（或加标质控试验） 5.4.2.1 质控样品 硼酸质控样品：采用典型样品基质或相似样品基质模拟实际生产工艺生产的，含有一 定量硼酸(可考虑基质本底最大可能硼酸量)，并可稳定保存的样品。样品需经参比方法确 认质控样品中硼酸的含量。 5.4.2.2 加标质控样品 硼酸加标质控样品：准确称取空白试样2g（精确至0.1g），加入适量硼酸标准溶液 （1000µg/mL 或100µg/mL）（3.3），使在不同基质样品中硼酸含量与5.4.2.1相同。 质控样品（或加标质控样品）按5.1和5.2步骤与样品同法操作。6 结果判定要求观察待测液的颜色，与标准色阶卡比较判读样品中硼酸的含量。颜色浅于检测限 （2.5mg/kg）则为阴性样品；颜色深于检测限的根据颜色的深浅进行判读。色阶卡见图1。 图1 硼酸色阶卡质控试验要求：空白试验测定结果应为阴性，质控样品试验测定结果应在其标示量值 允差范围内，加标质控试验测定结果应与加标量相符。7 结论由于色阶卡目视判读存在一定误差，为尽量避免出现假阴性结果，读数时遵循就高不 就低的原则。8 性能指标8.1 检测限：2.5mg/kg。8.2 灵敏度：灵敏度应99%。8.3 特异性：特异性应85%。8.4 假阴性率：假阴性率应1%。8.5 假阳性率：假阳性率应15%。注：性能指标计算方法见附录 A。9 其他本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法 时不作限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满 足本方法规定的各项性能指标。色阶卡应确保在试剂盒保质期内不出现褪色或变色的情况。若检测结果大于检测限，需对其进行研判，并采用参比方法确证。 本方法的参比方法为GB 5009.275-2016食品安全国家标准 食品中硼酸的测定 。附录A快速检测方法性能指标计算表表 A.1 性能指标计算方法检测结果b 样品情况a 阳性阴性总数阳性N11N12N1.=N11+N12阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或 N.1+N.2显著性差异(2)2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21), 自由度（df）=1灵敏度（p+，%）p+=N11/N1.特异性（p-，%）p-=N22/N2.假阴性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-灵敏度假阳性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特异性相对准确度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果；b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。用于确认方法时，结果2.5mg/kg 时，判定为阳性（仅用于计算性能指标）；c本方法规定：用于计算灵敏度和假阴性率的阳性样品，由参比方法检验得到的结果范围应在 2.510mg/kg 之间。N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行， 第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。d为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。本方法负责起草单位：陕西省食品药品监督检验研究院 验证单位：江南大学、四川省食品药品检验检测院、湖北省食品质量安全监督检验研究院 本方法的主要起草人为：李涛 林芳 袁磊 乔蓉霞 孙秀兰 王一欣 周陶鸿