食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法.docx

1附件 4食品中多种动物源性成分检测实时荧光 PCR 法BJS 2019041 范围本方法规定了肉及肉制品中猪、驴、山羊、绵羊、牦牛、鼠源性成分检测的实时荧光PCR 方法。本方法适用于肉及肉制品中猪（Sus scrofa）、驴（Equus asinus）、山羊（Capra hircus）、绵羊（Ovis aries）、牦牛（Bos grunniens）、鼠源性成分的一种或多种成分同时定性检测。注：本方法中鼠源性成分包括海狸鼠（Myocastor coypus）、小鼠（Mus musculus）、大鼠（Rattus norvegicus）、豚鼠（Cavia porcellus）和竹鼠（Rhizomy spruinosus）源性成分。2 原理提取样品DNA，通过特异性引物探针进行动物源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中产物荧光信号及扩增曲线判定，实现对样品动物源性成分的定性分析。3 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。3.1 检测用引物和探针(a) 猪 cytb 基因检测用引物探针序列为：5端引物：5-GCACTTTATCCTGCCATTCATCATT-33端引物：5-GTACAAGGATTAGTAGGATTAGT-3探针：5-FAM-CGCCCTCGCAGCCGTACATCTCCTA-BHQ1-3(b) 驴 nad5 基因检测用引物探针序列为：5端引物：5-GCTAGCCTCATTATCAGTAT-33端引物：5-GTGATGAGGATACGTGCT-3探针：5-FAM-TCATATCATCAATCCTCAACACCCACA-BHQ1-3(c) 山羊 cytb 基因检测用引物探针序列为：5端引物：5-CTTTATCCTCCCATTCATCATCA-33端引物：5-GAATTCCTGTGGGGTTGTTC-3探针：5-FAM-GCTCTCGCCATAGTCCACCTGCTTTTC-BHQ1-3(d) 绵羊 cytb 基因检测用引物探针序列为：25端引物：5-CTCATGCTACTAGTACTATTTACG-33端引物：5-GTACGCGAATAGGAAGTATCAT-3探针：5-FAM-TGACTTACTCGGAGACCCAGACAACTACAC-BHQ1-3(e) 牦牛 cytb 基因检测用引物探针序列为：5端引物：5-AACTTCGGCTCCATAGTAGGAGTA-33端引物：5-CGTCTCGGCAGATATGGACA-3探针：5-FAM-CGGAGGAGAATGCTGTTGTTGTATCGGATGT-BHQ1-3(f) 鼠 cytb 基因检测用引物探针序列为：5端引物：5-CTCCACGAGACAGGATCAAACAACCCATCAGGACTAAA-33端引物：5-TCATTCTGGTTTGATGTGGGGTGGGGTATT-3探针：5-FAM-TAGTGGGTTAGCAGGTGTGTAGTTGTCTGGGTCTC-BHQ1-33.2 CTAB 裂解液：2% (w/v) CTAB，1.4mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，用 10%盐酸调节 pH 至 8.0，121高压灭菌 20 min，备用。3.3 蛋白酶 K：20mg/mL，-20保存备用。3.4 苯酚三氯甲烷异戊醇（体积比 25241）。3.5 异丙醇，优级纯。3.6 70%乙醇。3.7 实时荧光 PCR 预混液。以 2×预混液为例，成分为：PCR 缓冲液（终浓度 1×），氯化镁（终浓度 2.5 mmol/L），dNTP（终浓度 0.2mmol/L），TaqDNA 聚合酶（终浓度 1 U）。3.8TE 缓冲液（Tris-HCl、EDTA 缓冲液）：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。4 仪器和设备4.1 组织研磨器。4.2 核酸蛋白分析仪。4.3 恒温水浴锅。4.4 离心机（最大离心力12000g）。4.5 微量移液器（0.1L2.5L，0.5L10L，10L100L，100L1000L）。4.6 实时荧光 PCR 仪。4.7 涡旋振荡器。4.8 电子天平：感量 0.01 g。4.9 高压灭菌锅。4.10 pH 计。35 分析步骤5.1 试样选取与制备多点采取肌肉组织，选取适量具有代表性的样品进行均质处理。所用器皿应为一次性耗材，或经过彻底清洗和高压消毒并单独使用。用过的器皿应采取措施消除核酸的污染，否则不可重复使用。5.2DNA提取称取解冻后的均质样品0.1g0.2g，置于2mL离心管中，加入600 L CTAB裂解液和20L蛋白酶K，振荡混匀，65孵育1h2h，期间每隔10min振荡混匀；加入500 L的苯酚：三氯甲烷：异戊醇（25241），充分振荡混匀，12000g离心5min；小心吸取上清液至洁净的1.5mL离心管内，加入等体积的异丙醇，振荡混匀，12000g离心5min；弃去上清液，500L70%乙醇洗涤2次，12000g离心5 min，弃上清液，晾干；加入50µL100µL TE缓冲液或无菌双蒸水，溶解DNA，-20保存备用。同法提取阳性对照、阴性对照及空白对照。也可用等效商品化的试剂盒提取DNA。5.3DNA浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪检测 DNA 浓度及纯度，DNA 浓度在 1ng/L100ng/L 之间，A260/A280 值在 1.72.0 之间时，适宜于本方法。5.4 实时荧光 PCR 扩增各动物源性成分PCR扩增均采用20L的反应体系，包括PCR反应预混液（2×）10L，5端、3端引物（10mol/L）各0.2L，探针（10mol/L）0.1L，DNA模板（1ng/L100ng/L）1L，用无菌双蒸水补足20L。每个样品设置两个平行反应体系。PCR扩增反应程序为：955min；35个循环（95 15s，58 1min，收集荧光）。也可用等效的商品化试剂盒进行扩增。5.5 实验对照实验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。用相应动物源性成分生鲜肉样品作为阳性对照，用不含相应动物源性成分的生鲜肉样品作为阴性对照，用等体积的无菌双蒸水代替模板DNA作为空白对照。6 结果判断与表述6.1 质量控制(a)空白对照：无FAM荧光信号检出；(b)阴性对照：无FAM荧光信号检出；(c)阳性对照：有FAM荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值30.0。否则判定为实验无效。6.2 结果判定4(a)如有FAM荧光信号检出，Ct值30.0，且出现典型的扩增曲线，则判定为被检样品阳性；(b)如Ct值35或无Ct值，则判定为被检样品阴性；(c)如有FAM荧光信号检出，且30.0Ct值35.0，则重新进行实验。如再次扩增后Ct值仍35.0，且有典型的扩增曲线，则判定被检样品阳性；否则判定被检样品阴性。6.3 结果表述结果为阳性者，表述为“检出XX源性成分”。结果为阴性者，表述为“未检出XX源性成分”。7 污染判定在DNA浓度相对差值在20%以内的情况下，本方法所检测生鲜肉与阳性对照差值6，或肉制品与阳性对照差值10，且结果可独立重复，提示该源性成分含量低于2%。8 防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。本方法负责起草单位：成都市食品药品检验研究院、中国科学院成都生物研究所、北京维德维康生物技术有限公司。验证单位：山东省食品药品检验研究院、中国检验检疫科学研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、河北省食品检验研究院、国家副食品质量监督检验中心，广州质量监督检测研究院。主要起草人：梁恒兴、尚柯、段庆梓、唐卓、张彪、马立才。