食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法.docx
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1、1附件 4食品中多种动物源性成分检测实时荧光 PCR 法BJS 2019041 范围本方法规定了肉及肉制品中猪、驴、山羊、绵羊、牦牛、鼠源性成分检测的实时荧光PCR 方法。本方法适用于肉及肉制品中猪(Sus scrofa)、驴(Equus asinus)、山羊(Capra hircus)、绵羊(Ovis aries)、牦牛(Bos grunniens)、鼠源性成分的一种或多种成分同时定性检测。注:本方法中鼠源性成分包括海狸鼠(Myocastor coypus)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、豚鼠(Cavia porcellus)和竹鼠(Rhizo
2、my spruinosus)源性成分。2 原理提取样品DNA,通过特异性引物探针进行动物源性成分的实时荧光PCR扩增,根据PCR扩增反应中产物荧光信号及扩增曲线判定,实现对样品动物源性成分的定性分析。3 试剂和材料除另有规定外,本方法所用试剂为分析纯或生化试剂,实验用水应符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。3.1 检测用引物和探针(a) 猪 cytb 基因检测用引物探针序列为:5端引物:5-GCACTTTATCCTGCCATTCATCATT-33端引物:5-GTACAAGGATTAGTAGGATTAGT-3探针:5-FAM-CGCCCTCGCAGCCGTACAT
3、CTCCTA-BHQ1-3(b) 驴 nad5 基因检测用引物探针序列为:5端引物:5-GCTAGCCTCATTATCAGTAT-33端引物:5-GTGATGAGGATACGTGCT-3探针:5-FAM-TCATATCATCAATCCTCAACACCCACA-BHQ1-3(c) 山羊 cytb 基因检测用引物探针序列为:5端引物:5-CTTTATCCTCCCATTCATCATCA-33端引物:5-GAATTCCTGTGGGGTTGTTC-3探针:5-FAM-GCTCTCGCCATAGTCCACCTGCTTTTC-BHQ1-3(d) 绵羊 cytb 基因检测用引物探针序列为:25端引物:5-CT
4、CATGCTACTAGTACTATTTACG-33端引物:5-GTACGCGAATAGGAAGTATCAT-3探针:5-FAM-TGACTTACTCGGAGACCCAGACAACTACAC-BHQ1-3(e) 牦牛 cytb 基因检测用引物探针序列为:5端引物:5-AACTTCGGCTCCATAGTAGGAGTA-33端引物:5-CGTCTCGGCAGATATGGACA-3探针:5-FAM-CGGAGGAGAATGCTGTTGTTGTATCGGATGT-BHQ1-3(f) 鼠 cytb 基因检测用引物探针序列为:5端引物:5-CTCCACGAGACAGGATCAAACAACCCATCAGGAC
5、TAAA-33端引物:5-TCATTCTGGTTTGATGTGGGGTGGGGTATT-3探针:5-FAM-TAGTGGGTTAGCAGGTGTGTAGTTGTCTGGGTCTC-BHQ1-33.2 CTAB 裂解液:2% (w/v) CTAB,1.4mol/L NaCl,20 mmol/L EDTA,100 mmol/L Tris,用 10%盐酸调节 pH 至 8.0,121高压灭菌 20 min,备用。3.3 蛋白酶 K:20mg/mL,-20保存备用。3.4 苯酚三氯甲烷异戊醇(体积比 25241)。3.5 异丙醇,优级纯。3.6 70%乙醇。3.7 实时荧光 PCR 预混液。以 2预混
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